Studentská vědecká konference

Hlavní částí této práce byla syntéza a metabolické začlenění modifikovaného cukru pro klick-značení glykokonjugátů.. Deriváty N-galakto, N-gluko a N-mannosamín hydrochloridu byly modifikovány pomocí 1,2,4-triazinové skupiny a dále převedeny na odpovídající peracetylované deriváty za účelem zvýšení jejich lypofilicity. Tyto sloučeniny byly aplikovány na buňky a kliknutím značeny biotinem, který umožňuje pozorovat začlenění nepřirozených cukrů do/na buňkách následným přidáním fluorescenčne značeným streptavidinem. Výhodou naší metody je netoxická a rychlá a reakce ve srovnání s jinými již známými metodami. Rychlost reakce byla sledována na derivátech thio-, sulfinyl-, karboxy-1,2,4-triazinů a třemi typy syntetických trans-cyklooktenů. Kvůli vedlejším produktům během syntézy a obtížnosti při čištění byly nakonec použity karboxy-1,2,4-triaziny a d-TCO. Po značení buněk tímto způsobem jsme neočekávaně zjistili, že použitím nových derivátů jsme schopni vizualizovat intracelulární glykokonjugáty, ale nikoli ty, které jsou spojeny s buněčným povrchem. 

Simulace molekulové dynamiky a metody z ní odvozené jsou cennými nástroji pro zkoumání vlastností a funkcí molekul. Metadynamika je metodou z molekulové dynamiky odvozenou, jež se snaží o zrychlení studovaných dějů pomocí přidávání externího potenciálu. Důležitá je přitom volba takzvané kolektivní proměnné, tedy veličiny, jejíž hodnota se pro různé konformace odlišuje a na kterou potenciál působí. V rámci této práce byla v jedné části zvolena zcela nová kolektivní proměnná, a to aproximované Rosetta skóre, jež charakterizuje, jak moc se model prostorové struktury blíží sbalené struktuře. Tato kolektivní proměnná byla vygenerována neuronovou sítí anncolvar. Neuronová síť byla nejprve trénována pouze na struktury z programu Rosetta, později i na struktury z našich trajektorií, aby byla schopna lépe rozpoznat sbalený a rozbalený protein. Veškeré simulace byly prováděny na subdoméně proteinu villin. Jednotlivé simulace se lišily přesností neuronové sítě či vstupním datasetem. Během simulací bylo pozorováno postupné rozvolňování struktury, avšak zatím ne její úplné rozbalení či sbalení. V druhé části byla použita další nová kolektivní proměnná – veličina vygenerovaná pomocí metody tSNE. Metoda tSNE dokáže efektivně reprezentovat vysokorozměrná data pomocí malého počtu proměnných.  

Fyziologické funkce, jako například řízení excitability neuronů nebo sekrece neurotransmitterů, jsou řízené vápníkovými kanály typu T, které jsou schopné se otevírat a zavírat v reakci na signály, jež k nim přichází. Poruchy těchto „gatingových“ vlastností jsou často spojené s neurodegenerativními lidskými nemocemi. Je tedy důležité pochopit strukturně-funkční vztahy v transmembránových proteinech vytvářející tyto kanály. V rámci tohoto projektu jsme zkoumali specifickou roli karboxylové terminální oblasti vápníkových kanálů Ca_v3.3, a to vytvořením řady deletovaných konstruktů exprimovaných v lidských buňkách, které jsme následně analyzovali pomocí patch-clamp elektrofyziologie. Naše výsledky ukazují, že proximální oblast C-konce obsahuje strukturní determinantu, která definuje několik funkčních aspektů kanálů Ca_v3.3 včetně napěťové závislosti aktivace a inaktivace, kinetiky inaktivace a vztahu mezi napěťovým senzorem kanálu a otevřením póru pro přenos iontů. Získané výsledky dokazují důležitost této oblasti pro stabilizaci kanálů Ca_v3.3 v uzavřeném stavu.

Endofyté jsou mikroorganismy kolonizující vnitřní tkáň rostlin bez negativního efektu na hostitele. Mohou být naopak pro rostlinu prospěšné. Mají např. kladný vliv na růst a vývoj rostlin tím, že, zvyšují dostupnost limitujících živin pro rostlinu, nebo zvyšují odolnost rostlin proti biotickému a abiotickému stresu. Tato práce je součástí projektu zabývajícího se sledováním vztahu endofytních mikroorganismů a metabolomu Vitis vinifera na základě několika proměnlivých faktorů, mezi které patří: vliv odrůdy, části rostliny, vegetační období a způsob pěstování. Naší výzkumnou částí bylo sledování funkčních změn endofytního bakteriálního konsorcia u čtyř běžně pěstovaných odrůd vinné révy na dvou vinicích s odlišným způsobem pěstování.  Zvoleny byly odrůdy: Ryzlink rýnský, Rulandské modré, Rulandské šedé a Müller Thurgau. U každé odrůdy se v několika časových odběrech sledovala schopnost konsorcia endofytů získaných z rostlinného pletiva stonků fixovat vzdušný dusík, solubilizovat fosfát, produkovat siderofory a indol-3-octovou kyselinu. Biochemické testy prokázaly schopnost endofytního konzorcia produkovat siderofory a indol-3-octovou kyselinu, a také solubilizovat fosfát u všech testovaných vzorků. Naopak nebyla potvrzena schopnost fixovat vzdušný dusík u žádné z testovaných odrůd.

S růstem výroby kovových nanočástic vzrostl i jejich obsah v okolním prostředí, kde znečišťují životní prostředí a mohou pronikat do jakéhokoliv organismu. Nanočástice, zejména do 50 nm, procházejí biologickými bariérami a interagují s mnoha intracelulárními strukturami – například inhibují enzymy, narušují vodivost membrány, vážou se na proteiny. A mohou nakonec způsobit i buněčnou smrt. Cytoskelet funguje jako určitý senzor změn v okolí buňky a odchylky v jeho dynamice mohou nastartovat celou kaskádu dějů, které buňce pomohou vyrovnat se s nepříznivými podmínkami. Pokusili jsme se zjistit, jak nanočástice ovlivňují dynamiku mikrotubulárního cytoskeletu a jeho schopnost regenerace v různých intervalech po ošetření kovovými nanočásticemi.

Bakulovirus je hmyzí vir, který se více jak 30 let používá pro produkci rekombinantních proteinů v hmyzích buňkách. Nicméně bakulovirus může být využit i k efektnímu přenosu a expresi genetické informace v savčích buňkách pomocí vhodného promotoru, tato metoda se nazývá BacMam. Cílem mé práce je vytvořit vektor pEGBacMam_EnvHIS, kterým transformací do buněk E.Coli DH10Bac vytvořím rekombinantní bacmid, nesoucí genetickou informaci pro produkci obalového glykoproteinu viru M-PMV (Env) s integrální HIS kotvou. Dále budu bacmidem transfekovat buněčnou linii Sf9 pro vytvoření rekombinantního bakuloviru, kterým budu následně infikovat savčí buňky HEK293 za účelem produkce proteinu Env. Tento expresní systém by měl zajistit silnější produkci žádaného proteinu, který bude navíc korektně glykosylován. Buňky budou následně lyzovány kopolymerem styrenu a kyseliny maleinové (SMA), který oddělí membránové proteiny i s lipidy v blízkém okolí, vzniknou tak tzv. SMA nanodisky. Nanodisky s cílovým proteinem budou z lyzátu získány pomocí afinitní chormatografie Ni-NTA. Takto izolovaný nativní protein je možné použít na interakční studie s matrixovým proteinem, výrobu protilátky proti proteinu Env a případně na určení struktury tohoto transmembránového proteinu pomocí kryoelektronové mikroskopie.  

Malý vzrůst mutanta A. thaliana pi4kβ₁β₂  je způsoben vysokou hladinou kyseliny salicylové (SA). Ta mutantovi zvyššuje odolnost proti patogenům. Navíc jsme zaznamenali zvýšenou hladinu kalosy u pi4kβ₁β₂. Nicméně neznáme mechanismus akumulace SA a kalosy v pi4kβ₁β₂. Vzhledem k roli PI4-kinas při transportu váčků, jsme se rozhodli prozkoumat spojitost mezi pi4kβ₁β₂ a BAK1 (Brassinosteroid Insensitive-associated kinase1), což je koreceptor váčkového transportu. Vytvořili jsme mutanta bak1pi4kβ₁β₂. Předpokládali jsme, že mutace BAK1 povede k revertaci růstového fenotypu pi4kβ₁β₂. K našemu překvapení jsme získali “super trpaslíka”. K prozkoumání tohoto efektu budeme charakterizovat růstový fenotyp, provedeme infiltraci patogenem P. syringae a měření kalosy. Dále jsme vytvořili mutanta sid2/bak1pi4kβ₁β₂, který má zablokovanou jednu z biosyntetických drah SA. Sid2 mutace by měla vést k navrácení většího vzrůstu. Zajímá nás růstový fenotyp, infiltrace patogenem P. syringae a měření kalosy. Tvorba kalosy je reakcí rostliny proti patogenům. Nejvíce kalosy se produkuje aktivita PMR4 (powdery mildew resistant 4). Pro sledování diferencí kalosy jsme vytvořili mutanta pmr4pi4kβ₁β₂, který také vykazuje super trpasličí vzrůst. Budeme charakterizovat růstový fenotyp a uložení kalosy v rostlině.