Studentská vědecká konference

Zloženie ľudskej kožnej mikroflóry je veľmi rozmanité a u každého jedinca špecifické. Dominantné zastúpenie tvoria baktérie rodu Staphylococcus, ktorých analýza by mohla nájsť využitie vo forenznej oblasti. Predpokladom pre túto analýzu je zavedenie spoľahlivých a rýchlych metód identifikácie a typizácie vybraných najčastejšie sa vyskytujúcich Staphylococcus spp. (S. aureus, S. cohni, S. epidermidis, S. haemolyticus, S. hominis, S. saprophyticus, S. warneri) využitím metód MALDI-TOF MS, RAPD-PCR, PFGE aj. a získané protokoly ďalej aplikovať na humánne izoláty týchto druhov Staphylococcus. V práci sme sa zamerali na identifikáciu a typizáciu druhu S. hominis metódou MALDI-TOF MS, s využitím zbierkových kmeňov a humánnych izolátov, ktoré boli taktiež identifikované pomocou súpravy STAPHYtest 24. Získané proteínové spektra zbierkových kmeňov boli využitím rôznych zhlukových analýz a programu ClinPro Tools (Bruker Daltonics) použité k vytvoreniu klasifikačných modelov, ktoré sme ďalej aplikovali k odlíšeniu S. hominis od ostatných Staphylococcus spp., či k odlíšeniu jednotlivých kmeňov S. hominis.

Bakterie rodu Cronobacter se řadí mezi oportunní patogeny, které jsou spojované s alimentárními a nozokomiálními infekcemi. Rizikovými skupinami jsou především novorozenci a imunodeficientní jedinci. Onemocnění způsobená bakteriemi tohoto rodu nejsou příliš častá, mají však vysokou letalitu, která v případě novorozeneckých meningitid dosahuje až osmdesáti procent. Virulentní faktory účastnící se patogeneze těchto bakterií nejsou v současné době dostatečně popsány. Identifikace potenciálně virulentních proteinů by mohla přispět k objasnění procesu patogeneze těchto bakterií. Následně by také mohla sloužit pro vývoj specifických imunochemických identifikačních metod jako je například metoda ELISA. V rámci této práce byly dvakrát nezávisle izolovány frakce vnější membrány, vnitřní membrány a periplazmy vybrané sady zástupců rodu Cronobacter. Jednotlivé frakce byly charakterizovány pomocí SDS-PAGE a imunoblotu, za použití protilátek proti celým buňkám a proti jednotlivým membránovým frakcím prokazatelně patogenního kmene Cb35. Proteiny membránových frakcí byly identifikovány pomocí hmotnostní spektrometrie (LC-ESI-Q-TOF MS). U všech identifikovaných proteinů byla prostřednictvím in silico analýzy určena jejich buněčná lokalizace.

Rod Bacillus patří mezi nejrozmanitější bakteriální rody. Vzhledem ke své schopnosti sporulace a široké enzymové výbavě je ubikvitně rozšířen a patří proto i mezi časté mikrobiální kontaminanty potravin. Mezi často izolované druhy způsobující kažení potravin patří B. subtilis, B. licheniformis a B. pumilus, zatímco B. cereus je původcem emetického či diarhogenního syndromu vzhledem ke své schopnost produkovat enterotoxiny v potravině (emetický toxin) či v tenkém střevě (hemolytický toxin HBL, nehemolytický toxin NHE). Cílem naší práci je proto zavést protokoly pro spolehlivou detekci, identifikaci a charakterizaci výše uvedených Bacillus spp. včetně genů pro enterotoxiny B. cereus metodami PCR a MALDI-TOF MS a tyto protokoly dále použít pro studium jejich výskytu v potravinách.Bylo použito 20 sbírkových kmenů a 9 izolátů z potravin. Při identifikaci metodou MALDI-TOF MS poskytla nejlepší výsledky metoda extrakce, kdy bylo dosaženo spolehlivé druhové identifikace pro skupinu B. cereus a B. subtilis a bezpečné rodové identifikace pro B. pumilus a B. licheniformis. Byly zavedeny a ověřeny druhově (B. cereus a B.licheniformis) a rodově specifické PCR protokoly a protokoly pro enterotoxiny HBL a NHE, jejichž přítomnost se prokázala u 66 %, resp. 100 % z 12 testovaných kmenů B. cereus.

Campylobacter jejuni je gramnegativní patogenní bakterie. Ze špatně tepelně upravených potravin, se dostává do zažívacího traktu, kde způsobuje záněty vedoucí ke gastroenteritidě, která je nejčastějším alimentárním onemocnění v EU. Četnost výskytu kampylobakterióz je v rozporu s citlivostí této mikroaerobní bakterie k vnějším podmínkám. C. jejuni se v potravinách nemnoží, v laboratoři je těžce kultivovatelný, a přesto jsou tyto bakterie poměrně často izolovány z různých vodních zdrojů. Cílem této práce je charakterizovat schopnost C. jejuni přežívat ve vodním prostředí za různých podmínek. Pro tento účel bude jako základ použita tradiční kultivační metoda počítání kolonií, kdy je sledován úbytek počtu kolonie tvořících jednotek v čase. Čím je tento úbytek rychlejší, tím je bakterie na dané podmínky náchylnější. Sledovány budou dva externí faktory: teplota (4, 25, 30, 37 °C) a složení vodního prostředí (destilovaná voda, fyziologický roztok, voda z řeky/rybníka, BHI), a to u tří sbírkových kmenů C. jejuni. Naměřená data budou ověřena pomocí průtokové cytometrie spojené s vitálním barvením bakterií. Předpoklad je takový, že voda z přírodního zdroje bude ve spojení s nižší teplotou podporovat přežití C. jejuni kvůli snížené metabolické aktivitě a přítomnosti ochranných látek.

Salmonelóza je druhým nejčastějším gastrointestinálním onemocněním v  Evropě. Původcem salmonelózy jsou některé sérotypy bakterií rodu Salmonella z čeledi Enterobacteriaceae. Tyto bakterie jsou schopny nejen na abiotických površích v potravinářské výrobě tvořit biofilm - vícebuněčnou mikrobiální komunitu. Biofilm jim umožňuje dlouhodobě přežívat v nepříznivých podmínkách. Trojrozměrná struktura biofilmu je poté tvořena převážně z exopolysacharidů (celulóza, sacharidové složky O-antigenu) a z proteinů (bičíky, povrchový protein BapA, svazky fimbrií - tzv. curli). Hlavním regulátorem tvorby biofilmu je transkripční aktivátor CsgD, který aktivuje transkripci genů zajišťujících syntézu složek biofilmu. Cílem naší práce je predikce tvorby biofilmu na základě genetické analýzy. Pomocí PCR amplifikace regulační oblasti a části vnitřní sekvence genu csgD byl jeho výskyt prokázán u všech 55 studovaných kmenů Salmonella spp. Pro dva kmeny Salmonella Typhimurium s odlišnou mírou tvorby biofilmu byly poté srovnány sekvence PCR produktů amplifikace regulační oblasti. U těchto kmenů byl dále stanoven profil tvorby biofilmu v závislosti na teplotě, složení média a obsahu glukózy, sacharózy a laktózy při různých metodách semikvantifikace biofilmu v mikrotitrační destičce krystalovou violetí.

Listerióza je alimentární onemocnění způsobené grampozitivní bakterií Listeria monocytogenes. Největším rizikem nákazy je konzumace potravin, jako jsou zrající sýry, saláty, syrové maso nebo nepasterizované mléko. Listerie se do potravin často dostává již ve výrobě z povrchů výrobních zařízení, které pokrývá vrstvou biofilmu. Tento biofilm je prakticky neviditelný a velice odolný vůči stresovým podmínkám, jako je chlad, nízké pH, vysoká koncentrace solí nebo působení dezinfekčních prostředků. Součástí biofilmu jsou kromě nukleových kyselin a proteinů také exopolysacharidy. Cílem této práce je z matrice biofilmu vhodnými metodami porovnat složky polysacharidů u jednotlivých kmenů L. monocytogenes a zjistit, jakým způsobem ovlivňují okolní podmínky jejich produkci.

Bakterie rodu Cronobacter jsou podmíněnými patogeny způsobujícími závažná onemocnění u imunokompromitovaných jedinců. Navzdory těžkým průběhům těchto onemocnění není dosud přesně popsaná jejich patogeneze. Navíc se jednotlivé druhy liší svou virulencí, přičemž onemocnění způsobuje nejčastěji C. sakazakii. Tato práce porovnává zastoupení imunogenních membránových proteinů u patogenního kmene C. sakazakii Cb 35 a u zástupců ostatních druhů s následným zaměřením na virulentní proteiny. Membránové proteiny byly rozdělené do frakcí vnější membrány, periplasmy a vnitřní membrány pomocí série ultracentrifugací. Následně byly z frakcí odděleny imunogenní proteiny použitím magnetických částic s navázanými polyklonálními protilátkami. Pro analýzu proteinů byla použita hmotnostní spektrometrie. Identifikovány byly desítky proteinů u jednotlivých kmenů v rámci každé frakce. U všech těchto proteinů bylo určeno pravděpodobné umístění v buňce. Následně bylo podle dostupné literatury vybráno jedenáct potenciálně virulentních membránových proteinů, které by mohly přispívat k virulenci bakterií rodu Cronobacter.

Rod Enterobacter patří mezi významné rody čeledi Enterobacteriaceae a zahrnuje 22 druhů. Druhy E. asburiae, E. cloacae, E. hormaechei, E. kobei, E. ludwigii si jsou na genetické i fenotypové úrovni natolik podobné, že jsou řazeny do druhové skupiny označované jako Enterobacter cloacae komplex. Tyto druhy jsou ubikvitně rozšířeny v životním prostředí. Řadí se poté k častým kontaminantům potravin, kde způsobují kažení, a jsou i častými původci nozokomiálních infekcí. Pro stanovení zdrojů kontaminace a infekce je proto důležitá přesná identifikace na úrovni druhu, příp. poddruhu a typizace na úrovni kmene. Tato identifikace v praxi dostupnými standardními metodami je však poměrně obtížná, až nemožná. Cílem této práce bylo stanovení spolehlivosti standardních postupů identifikace Enterobacter cloacae komplex metodami ENTEROtest 24 N a MALDI-TOF MS s použitím software Bruker Biotyper. Pro odlišení proteinových profilů E. cloacae a E. hormachei a jejich typizaci byly vytvořeny a srovnány různé klasifikační modely. K vytvoření modelů byly použity software mMass, ClinPro Tools a proteinové profily sbírkových kmenů získané třemi metodami přípravy vzorku. Vybrané modely umožnily stanovit druhově specifické markery a byly následně použity pro identifikaci potravinových izolátů.

Grampozitivní bakterie Staphylococcus aureus je nebezpečný oportunní patogen, který kolonizuje kůži a povrchy sliznic člověka a dalších savců. Je schopná tvořit biofilm, což má často za následek vznik chronických infekcí vznikajících po hospitalizaci pacienta v nemocnici. Biofilm se může také tvořit na katetrech, implantátech či kloubních náhradách. Proto je důležité se zabývat mechanismy odstranění biofilmů či zabránění jejich růstu. Součástí těchto biofilmů jsou amyloidní proteiny zvané modulíny rozpustné ve fenolu (PSM), které v biofilmu zastávají významné funkce. Práce je zaměřena právě na studium biofilmu vybraných kmenů S. aureus ze sbírky ZL ÚBM. Vizualizace biofilmu i PSM je prováděna pomocí mikroskopických metod. Metodou CTAB byla izolována DNA vybraných bakteriálních kmenů S. aureus a jednotlivé PSM byly amplifikovány metodou PCR. Stříbrné i zlaté nanočástice vykazují antimikrobiální aktivitu proti bakteriím a mikromycetám. Pro úspěšnou aplikaci nanočástic jako antibakteriálních agens je nezbytné porozumět jejich vlivu nejen na bakteriální buňky, ale i na biofilmy. V této práci bude studován vliv stříbrných a zlatých nanočástic na adhezi buněk a tvorbu biofilmu S. aureus. Dále se bude ověřovat vliv nanočástic na hladinu transkripce genů PSMα a PSMβ.

Při produkci potravin může docházet k jejich napadení mikromycetami. Ty nejenže znehodnocují potravinu jako takovou, ale také mohou produkovat toxiny. Patulin a ochratoxin A (OTA) jsou mykotoxiny s hepatotoxickými, imunosupresivními a potenciálně i karcinogenními účinky, produkované zejména mikromycetami rodů Aspergillus a Penicillium. Tyto mikromycety lze detekovat např. pomocí molekulárně biologických metod, tato práce je zaměřena na PCR a LAMP (Loop-Mediated Isothermal Amplification). Naším cílem je tedy navrhnout takové PCR a LAMP protokoly, pomocí kterých bude možné bezpečně rozlišit, zda jsou přítomné mikromycety schopny produkovat patulin či OTA. Poněvadž je syntéza mykotoxinů typicky vícekroková, byly pro práci vybrány klíčové enzymy biosyntetické dráhy obou mykotoxinů, konkrétně polyketid-synthasa (PKS) pro OTA a isoepoxydondehydrogenasa (IDH) pro patulin. Doposud se podařilo izolovat DNA z mikromycet získaných ze sbírek VŠCHT, dále bude pomocí PCR ověřena jeho amplifikovatelnost a poté bude experimentálně ověřen protokol pro detekci genů kódujících klíčové enzymy biosyntetických drah obou mykotoxinů.