Studentská vědecká konference

Protein visfatin se v organismu nachází v intracelulárním i extracelulárním prostředí. Přestože má visfatin v extracelulárním prostředí několik funkcí, není objasněn mechanismus jeho sekrece. Předpokládá se, že je secernován některou z neklasických sekrečních drah. Jako zdroj extracelulární formy visfatinu jsou označovány adipocyty, hepatocyty a makrofágy. Avšak naše předchozí práce prokázaly aktivní sekreci visfatinu pouze u buněk imunitního systému. Cílem práce bylo získání nových poznatků ohledně intracelulární lokalizace visfatinu u U937 makrofágů, se záměrem objasnit mechanismus jeho sekrece. Pro určení intracelulární lokalizace visfatinu byla připravena linie U937 se stabilní produkcí visfatinu ve fúzi se zeleným fluorescenčním proteinem (GFP-visfatin). U této linie byla ověřena syntéza a aktivní sekrece GFP-visfatinu pomocí imunoblotu. Fluorescenční mikroskopií na fixovaných i nativních buněčných preparátech byla sledována intracelulární lokalizace GFP-visfatinu, který se nacházel převážně v cytoplasmě a poblíž cytoplasmatické membrány. Dále bylo zjištěno, že se visfatin nachází ve váčcích, které se uvolňovaly z buněk. Výsledky naznačují, že makrofágy aktivně sekretují visfatin pomocí transportních váčků.

Srdeční glykosidy zahrnují pestrou skupinu látek živočišného i rostlinného původu. V medicíně se díky svému pozitivnímu ionotropnímu účinku využívají při léčbě srdečního selhání a srdečních arytmií. Tento účinek je zprostředkován pomocí inhibice sodno-draselné ATPasy (NKA) – membránového proteinu – jehož inhibice vede mimo jiné také k apoptóze buňky. Digitoxin a jeho deriváty byly díky zmíněnému faktu v této práci studovány pro svůj potenciál stát se v budoucnu možnými teranostatiky, tedy látkami snoubícími v sobě jak terapeutické, tak diagnostické vlastnosti, v léčbě rakoviny. Testováno bylo celkem 11 látek: digitoxin, jeho fluorescenční i nefluorescenční deriváty a samotné fluorofory. K tomuto účelu byly vybrány metody molekulového dockování, testy cytotoxicity na tkáňových liniích A549, HEK 293T, MRC-5 a L929 pomocí WST-1 a fluorescenční mikroskopie. Bylo zjištěno, že digitoxin a jeho deriváty vykazují výrazné cytotoxické účinky na buňky linií A549, HEK 293T a MRC-5. Jako další budou provedeny kolokalizační studie s markery buněčných organel a kolokalizační studie s fluorescenční NKA.

G-quadruplexes can multimerize under certain conditions, but the sequence requirements of such structures are not well understood. In this study, we investigated the ability of all possible variants of the central tetrad in a monomeric, parallel-strand G-quadruplex to form higher-order structures. Although most of these 256 variants existed primarily as monomers under the conditions of our screen, ∼10% formed dimers or tetramers. These structures could form in a wide range of monovalent and divalent metal ions, and folding was highly cooperative in both KCl and MgCl₂. As was previously shown for G-quadruplexes that bind GTP and promote peroxidase reactions, G-quadruplexes that form dimers and tetramers have distinct sequence requirements. Some mutants could also form heteromultimers, and a second screen was performed to characterize the sequence requirements of these structures. Taken together, these experiments provide new insights into the sequence requirements and structures of both homomultimeric and heteromultimeric G-quadruplexes.

Na zinku závislá nukleasa náleží do rodiny S1-P1 nukleas, které jsou studovány především pro své biotechnologické využití a případné aplikace v medicíně. Jedná se o jednořetězcově specifickou nukleasu, jejíž produkty a zároveň kompetitivní inhibitory jsou 5‘-mononukleotidy, mononukleosidy i ionty fosfátu. Byly objasněny struktury komplexů této nukleasy s produkty štěpení DNA. Díky těmto výsledkům byla vysvětlena vysoká schopnost přizpůsobení aktivního místa přítomnému ligandu, a tím i nespecifita k bázím. Cílem této práce je studium interakce této nukleasy s RNA na základě struktur komplexů nukleasy s produkty štěpení RNA a následné porovnání výsledků s daty naměřenými pro vazbu ssDNA. Z měření rentgenové difrakce krystalů těchto komplexů byla získána data s vysokým difrakčním limitem. Tato data byla zpracována. Dvě struktury komplexů nukleasy s ligandy uridinem a cytidin-5‘-monofosfátem byly vyřešeny a upřesněny. Z dosavadních výsledků je jasné, že způsob interakce s těmito ligandy je velmi podobný jako s produkty štěpení ssDNA.

Tuberkulóza je mezi deseti nejčastějšími příčinami úmrtí na světě. I když existují různá antibiotika proti tuberkulóze, stále častěji se objevují nové kmeny, které jsou multirezistentní. Proto je třeba nalézt nové cíle antibiotik. Jedním z možných cílů se ukazují Toxin-antitoxin (TA) systémy. Antitoxin, je nestabilní molekula, která tvoří komplex s toxinem a inhibuje ho. Při změně podmínek se komplex rozdělí a uvolní se samotný toxin, který bakterii zabije. MbsTA (mycobacterial suicide Toxin-Antitioxin) byl vybrán jako vhodný cíl pro návrh nových antibiotik, protože není sekretován z buňky a MbsT je pro tuto bakterii silně toxický. Tato práce se zabývá stabilitou MbsTA komplexu, produkcí volného MbsT a určení jeho katalytické aktivity in vitro pomocí fluorescenčního stanovení NAD(P)⁺.

Lipidová tělíska jsou samostatné organely. V rostlinách se nejčastěji vyskytují v endospermu semen a jsou zapojeny do mnoha fyziologických procesů. Slouží například jako úložiště energie ve formě triacylglycerolů. Povrch lipidových tělísek je stabilizován proteiny, mezi které patří mimo jiné také strukturní proteiny nazývané oleosiny. Oleosiny se skládají z dlouhé vnitřní hydrofobní domény (až 70 AMK zbytků) a ze dvou kratších hydrofilních domén N-koncové a C-koncové (cca 30–70 AMK zbytků). Důležité je, že délka hydrofobních domén se mezi oleosiny neliší, zatímco délka hydrofilních domén ano. Ve své práci se zabývám konkrétně oleosinem 2 (At5g40420), který je v semenech rostlin nejčastěji zastoupený a má nejdelší hydrofilní domény (56 a 71 AMK zbytků). Cílem mé práce je připravit hydrofilní domény nejprve jako samostatné peptidy a poté také jako fúzní peptidy spojené pomocí linkeru. Takto připravené peptidy budou použity ke studiu vlastností a krystalografii. V současné době probíhá příprava expresního plasmidu pET16b nesoucího úsek genu kódujícího C-koncovou doménu oleosinu 2.

Titanové materiály jsou nejpoužívanějším biomateriálem pro kloubní náhrady. V současné době je vyvíjeno velké úsilí používané materiály modifikovat tak, aby byly zlepšeny jejich mechanické vlastnosti i interakce s tkáněmi. Sledování změn proteomu kmenových buněk v průběhu kultivace v médiu s osteodiferenciačními faktory by mohlo sloužit ke zjištění potenciálních biomarkerů, které by se daly využít k pozorování reakce buněk při růstu na nových biomateriálech. Tato práce se zabývá sledováním změn v proteomu buněk hTERT, imortalizovaných lidských kmenových buněk odvozených od tukové tkáně, v průběhu růstu v kontrolním médiu a médiu obsahujícím osteodiferenciační faktory. Po 7, 14 a 21 dnech růstu byly buňky lysovány, izolované proteiny rozštěpeny trypsinem a zastoupení jednotlivých proteinů určeno pomocí label-free kvantifikace ve spojení s kapalinovou chromatografií a hmotnostní spektrometrií. Naměřená data byla podrobena statistickému a bioinformatickému vyhodnocení. Bylo zjištěno, že nejvýznamnější změny v hladinách proteinů oproti kontrolnímu médiu nastaly u buněk po 14 dnech kultivace, přičemž mezi nejvíce zasažené procesy patřily metabolismus kolagenu a organizace extracelulární matrix.

Mykobakterie jsou rod grampozitivních bakterií zahrnující několik významných lidských patogenů. Nejvýznamnějším z nich je bezesporu původce tuberkulózy – Mycobacterium tuberculosis (MTB).  Touto bakterií je v současnosti nakažena až třetina veškeré světové populace a s více než 1,5 miliony úmrtí ročně je na první příčce v počtu úmrtí na infekční choroby. Jedním z problémů v boji s MTB je schopnost tvořit vysoce perzistentní buňky. Za tento jev může z velké části tzv. stringentní odpověď řízená pomocí signální molekuly (alarmonu) (p)ppGpp. Centrálním regulátorem její hladiny je protein Rel, který by díky tomu mohl být zajímavým cílem nových chemoterapeutik. Pro studium proteinu Rel byl použit modelový organismus nepatogenní Mycobacterium smegmatis (MSM). Byl připraven kmen s úplnou delecí Rel a následně sledován její fenotypový projev na buňkách za různých růstových a stresových podmínek. Dalším z přístupů je hledání nových potenciálních interakčních partnerů proteinu Rel. Pro tento účel bude vytvořena DNA knihovna MSM, kterou lze poté využít ke studiu interakcí pomocí bakteriálního dvouhybridního systému. Zavedení a ověření funkčnost výše zmíněných metod by mohlo v budoucnu pomoci pochopit fascinující a stále nedostatečně popsaný systém stringentní odpovědi u mykobakterií.

Mycobacterium tuberculosis (MTB) způsobuje onemocnění tuberkulózu, na kterou ročně zemře více než 1 500 000 lidí. Přestože nemoc je antibiotiky léčitelná, léčba nebývá vždy účinná. Jedna z příčin neúčinné terapie je i schopnost mikroorganismu přežívat v extrémních podmínkách za hypoxie a vysokého oxidačního stresu v dormatním stavu. Do toho se stavu se mykobakterie může dostat díky útlumu metabolismu, který je součástí tzv. stringentní odpovědi. Tato stresová odpověď je řízena signální molekulou (p)ppGpp zvanou alarmon. Předpokládá se, že na regulaci alarmonu se podílí i protein RnhD, která navíc disponuje nukleázovou aktivitou. Znalost mechanismu působení tohoto proteinu by mohl poskytnout nové cesty léčby tuberkulózy. Ke studiu této dráhy využíváme modelový nepatogenní organismus Mycobacterium smegmatis, ze kterého byl izolován gen pro RnhD. Cílem bylo vložit tento gen do vektoru pTriex.Ti vhodného pro produkci cílového proteinu v E.coli, vyizolovat a přečistit exprimovaný protein a ověřit jeho katalytické vlastnosti.

Rutinosidasa (α-L-rhamnosyl-β-D-glykosidasa; EC 3.2.1.168) je enzym ze skupiny diglykosidas, který odštěpuje disacharid rutinosu z příslušného rutinosidu. Rutinosidasy se vyskytují v bakteriích, archebakteriích a plísních. Některé z nich ukazují navíc i transglykosylační aktivitu, což je vlastnost nezbytná k syntéze nových rutinosidů. V rámci diplomové práce byla provedena exprese jedné fungální rutinosidasy (Mucor circinelloides) v expresním systému Komagataella pastoris.  Gen kodující rutinosidasu byl vložen do expresního vektoru pPICZαA pro sekreci rekombinantního enzymu do kultivačního média; následovala transformace hostitelských buněk vzniklým plasmidem. Po integraci cizorodé DNA byl proveden screening aktivních transformantů fluorogenním substrátem 4-methylumbelliferyl-rutinosidem pomocí nativní elektroforézy. Aktivní klony byly kultivovány ve větším měřítku. Biomasa byla centrifugována a rekombinantní protein byl izolován afinitní chromatografií na základě C-terminální histidinové kotvy enzymu. Purifikovaný enzym byl vysrážen síranem amonným. V současné době probíhá charakterizace rekombinantní rutinosidasy: stanovení teplotního optima, pH optima, substrátového spektra, optimálních podmínek pro transglykosylační aktivitu atd.