Studentská vědecká konference

V posledných rokoch sa na trhu objavuje čím ďalej tým viac nových syntetických drog. Dôvodom je snaha vyrobiť psychoaktívne látky, ktoré by boli legálne. Tieto látky sa často vyrábajú z už existujúcich liečiv či drog pozmenením ich štruktúry, čím sa stávajú legislatívou nepostihnuteľné. S rastúcim počtom prípadov ich zneužitia preto rastie aj dopyt po efektívnej metóde ich štúdia. Keďže syntetické drogy a ich prekurzory účinkujú prostredníctvom interakcie s receptormi spojenými s G-proteínom, cieľom tejto práce je zistiť, na ktoré receptory konkrétne tieto látky pôsobia. Práve za týmto účelom sme vytvorili bunkovú líniu produkujúcu dopamínové receptory D1 a D2 použitím reportérového systému TANGO. Pretože tento systém funguje na princípe aktivácie prepisu reportérového génu pre luciferázu vždy pri naviazaní látky na receptor, sme schopní jednoznačne určiť interakciu medzi neznámou látkou a dopamínovým receptorom. S použitím navrhnutého systému bude možné dosiahnuť náš hlavný cieľ, ktorým je otestovanie knižnice látok s neznámym cieľovým receptorom. 

Nádory postihující epiteliální tkáň hlavy a krku (HNSCC) jsou 6. nejčastějším typem rakoviny na světě s každoročním nárůstem o 650 000 nových případů a s více než 50% mortalitou. Nepříznivým faktorem je i to, že se jedná o heterogenní skupinu nádorů, která se liší patogenezí, lokalizací, biologií a léčbou. Mezi hlavní rizikové faktory patří kouření, alkohol a HPV infekce. HPV status je významným prognostickým faktorem, díky němuž lze onemocnění rozdělit na dvě skupiny. Skupina HPV pozitivních nádorů, která je charakteristická pro mladší sexuálně aktivní ženy, má výrazně lepší prognózu, zatímco HPV negativní nádory jsou typické pro muže nad 60 let, kteří kombinují kouření a pití alkoholu a mají obecně horší prognózu. Pro zlepšení prognostických postupů a navržení nových typů léčby je nutné identifikovat nové cíle, které podmiňují vznik tohoto onemocnění,   Tato práce má za cíl popsat možný vliv signální dráhy ERK, zvláště pak proteinkináz ERK1 a ERK2, na vznik a vývoj HNSCC. Analýzou expresních profilů bylo zjištěno, že 80 % nádorů má sníženou hladinu proteinkinázy ERK1, ale ne ERK2, což naznačuje, že by proteinkináza ERK1 mohla mít tumor-supresorovou funkci. Pro ověření této hypotézy jsou prováděny expresní profily ve vzorcích nádorové tkáně a buněčných linií odvozených od HNSCC.

Matrixový protein (MA) tvořící N-terminální doménu polyproteinu Gag hraje u viru HIV významnou roli při transportu polyproteinu Gag k buněčné membráně. MA též zajišťuje interakci s membránou, čímž je iniciována tvorba virových částic a jejich pučení z hostitelské buňky. V předchozích studiích bylo zjištěno, že pro vazbu MA na membránu je zásadní jeho myristoylace a interakce vysoce bazického regionu s fosfatidylinositol-4,5-bisfosfátem (PI-4,5-P₂). K vazbě též přispívá fosfatidylserin (PS). Tato práce je zaměřena na odhalení interakčního rozhraní mezi MA a PS. Metodou povrchového mapování, která je založena na detekci specifických kovalentních modifikací dostupných aminokyselin prostřednictvím hmotnostní spektrometrie, jsou studovány změny povrchové dostupnosti vybraných aminokyselin (lysin, tryptofan a tyrosin) po vazbě MA na liposomy obsahující PS. Změny v dostupnosti po interakci s liposomy byly detekovány u lysinů a tryptofanů, což může značit jejich možné zapojení do interakce s PS. V případě lysinů byly, stejně jako u liposomů obohacených o PI-4,5-P₂, detekovány změny v první bazické oblasti, avšak interakce mezi lysiny a PS se nezdá být tak specifická jako v případě PI-4,5-P₂. Naproti tomu výsledky modifikací tyrosinů neposkytují indicie o jejich zapojení do interakce.

Mechanismus transportu a uvolňování nových virových částic spočívá u viru lidské imunodeficience (HIV) v interakci matrixového proteinu (MA) s cytoplazmatickou doménou polyproteinu Env (CT). U Mason-Pfizerova opičího viru (M-PMV), který se ve zmíněných mechanismech od HIV odlišuje, nebyla daná interakce dosud prokázána. Dosavadní studie však naznačují, že i u M-PMV může tato interakce hrát roli ve virovém transportu uvnitř hostitelské buňky. V rámci naší studie byla využita metoda in vitro proteinového prokřižování s následnou hmotnostně-spektrometrickou analýzou, která umožňuje detekci a identifikaci prokřížených peptidů. Detekce prokřížených peptidů pocházejících současně z MA a CT by tak nejen potvrdila interakci těchto dvou proteinů, ale též přispěla k odhalení oblastí, které jsou za interakci zodpovědné. Na základě získaných dat byla prokázána přítomnost obou proteinů v jednotlivých analyzovaných zónách. Pomocí softwaru StavroX však nebyly nalezeny žádné relevantní signály prokřížených peptidů. Z dosavadních výsledků tedy není možné usuzovat, zda k dané interakci opravdu dochází. V budoucnu bude proto studována interakce také mezi dalšími formami zmíněných proteinů či budou využity jiné softwary pro spolehlivé vyhodnocení dat.

Předpokladem pro vývoj nových inhibitorů skládání retrovirové částice je detailní znalost její struktury, díky níž mohou být vytipovány aminokyseliny důležité pro protein-proteinové interakce v rámci částice. Tyto interakce jsou zprostředkované především aminokyselinami v kapsidovém proteinu viru (CA), který je tvořen dvěma doménami, N-terminální doménou (NTD) a C-terminální doménou (CTD). Na základě struktury NTD CA proteinu Mason-Pfizerova opičího viru (M-PMV) byly určeny aminokyseliny, které by se na proteinových interakcích v částici měly podílet. Nejprve byly připraveny DNA konstrukty kódující proteiny nesoucí mutace vybraných aminokyselin NTD CA pro přípravu strukturních proteinů v bakteriálních buňkách a pro následné studium tvorby částic z těchto proteinů in vitro. Poté byly připraveny odpovídající DNA konstrukty kódující celovirový genom, které byly využity pro transfekci vhodných buněk tkáňových kultur pro sledování vlivu mutací na životní cyklus viru. Zjistili jsme, že některé z mutací vybraných aminokyselin CA proteinu ovlivňují morfologii částic M-PMV a infektivitu tohoto viru a jsou tedy velmi významné pro jeho životní cyklus.

Masonův-Pfizerův opičí virus (M-PMV) je retrovirus a důležitý modelový organismus pro studium životního cyklu retrovirů. V jeho životním cyklu hraje klíčovou roli N-terminální doména Gag polyproteinu, matrixový protein (MA), který zprostředkovává transport nezralé virové částice uvnitř buňky a její následnou interakci s buněčnou membránou. Většina retrovirových MA je N-terminálně myristoylována. Myristoyl slouží jako signál pro cílení virové částice k membráně a jako kotva pro interakci s membránou. Nalezení nových proteinů hostitelské buňky interagujících s MA by mohlo přispět k bližšímu objasnění procesu transportu uvnitř hostitelských buněk a interakce s buněčnou membránou. V rámci této práce byl proveden s myristoylovaným a nemyristoylovaným MA GST-pull-down proti lyzátům buněk linií COS-1, HeLa a HEK 293T. Interagující proteiny byly identifikovány pomocí hmotnostní spektrometrie. Z analýzy vzešel jako zajímavý interakční partner vakuolární třídící protein 28 (VPS28). Jedná se o jednu ze tří podjednotek komplexu ESCRT-I, který hraje nezbytnou roli v řadě procesů včetně pučení virů. VPS28 byl připraven rekombinantně a jeho interakce s MA je ověřována pomocí NMR spektroskopie.

Obezita je častou metabolickou poruchou, ovlivňující několik dalších životně nebezpečných nemocí, včetně diabetes mellitus typu 2, hypertenze a aterosklerózy. Několik studií také ukazuje, že pacienti s diabetem mají o 50 - 75 % zvýšenou pravděpodobnost výskytu Alzheimerovy choroby a naopak. Jelikož se výskyt obezity stále zvyšuje, bylo by užitečné najít účinnou neinvazivní terapii. Zajímavou  metodou pro léčbu obezity by mohly být centrálně uvolňované a působící anorexigenní neuropeptidy, nicméně jejich dodání z periferie do mozku je komplikované, jelikož tyto peptidy mají nízkou stabilitu a limitovaný prostup skrze hemato-encefalitickou bariéru a není je proto možné podávat periferně. Jednou z modifikací, která může vést k lepší prostupnosti přes hemato-encefalickou bariéru, je lipidizace peptidů.  Cílem této práce je farmakologická charakterizace nových stabilních lipidizovaných analogů anorexigenního peptidu uvolňujícího prolaktin (PrRP) a to jak z hlediska vazby na receptor a signalizace v in vitro testech na buňkách s receptorem GPR10 a na neurálních buňkách SY5Y, tak z hlediska příjmu potravy u myší v in vivo testech. Zároveň probíhá měření apoptotických účinků u buněk SY5Y po působení methylglyoxalu a vliv analogů PrRP na apoptozu, případně jejich neuroprotektivní účinky.

Nádorová onemocnění představují druhou nejčastější příčinu úmrtí ve světě. Při transformaci nenádorové buňky na buňku nádorovou dochází k podstatné změně v buněčném metabolismu. Hlavní úlohu v tomto „boji o přežití“ hrají zásoby nutrientů, v čele se dvěma nejdůležitějšími energetickými a stavebními zdroji, glukosou a glutaminem. Tato práce se zaměřuje na druhý z těchto metabolitů, glutamin, na jehož roli v nádorové buňce nespecificky cílí léčivo, běžně používané pro léčbu akutní lymfoblastické leukémie, asparaginasa. Na lidských nádorových liniích adenokarcinomu pankreatu PaTu, karcinomu děložního čípku HeLa a kontrolní nenádorové linii fibroblastů HDF byl studován vliv glutaminu, konkrétně jeho akutní a chronické deplece. Po čtyřdenní kultivaci buněk a následném vystavení zvýšenému oxidačnímu stresu aplikací peroxidu vodíku byla s využitím resazurinu měřena viabilita buněk. Z naměřených dat vyplývá, že již akutní deplece glutaminu zásadním způsobem snižuje odolnost buněk vůči oxidačnímu stresu. Této skutečnosti by mohlo být využito při terapii chemo/radioresistentních solidních tumorů.