|
---
|
Bc.
Tomáš
Ludvík
|
M2
|
prof. Ing. Tomáš Ruml, CSc.
|
Příprava a charakterizace vybraných nestrukturních proteinů +RNA virů
|
detail
Příprava a charakterizace vybraných nestrukturních proteinů +RNA virů
V rámci této práce bude věnována pozornost nestrukturnímu proteinu 2A z rodiny Picornaviridae. Jedná se o rozmanitou skupinu kódujících ssRNA virů. Z této velké skupiny virů jsem se zaměřil na Aichi virus a Coxsackie virus B3. Oba viry patří mezi lidské patogeny, Aichi virus je původcem gastroenteritidy a Coxsackie virus B3 může v nejhorších případech způsobit dilatační kardiomyopatii. Kardiomyopatie vede ke špatné funkci srdce důsledkem jeho rozšíření. Protein 2Apro Coxsackie viru B3 zastává mnoho důležitých funkcí v jeho životním cyklu. Jedná se o proteasu, jež se podílí na štěpení virového polyproteinu. Pomocí 2Apro dokáže virus obejít imunitní odpověď hostitele a zastavit produkci klíčových hostitelských proteinů. Z tohoto důvodu je 2A proteasa vhodným cílem pro zásah antivirotiky. Cílem této práce je připravit a charakterizovat dva rekombinantní proteiny 2A z Aichi viru a Coxsackie viru B3. Prvním krokem je příprava expresních plasmidů. Následně bude provedena metoda rekombinantní exprese. Druhým krokem bude izolace a purifikace rekombinantních 2A proteinů. V posledním kroku této práce budeme získané rekombinantní proteiny studovat, bude se jednat o enzymatickou charakterizaci těchto proteinů či případné vyřešení struktury metodou proteinové krystalografie.
|
|
---
|
Bc.
Ľubomíra
Papíková
|
M2
|
doc. Ing. Petra Lipovová, Ph.D.
|
Nespecifická fosfolipasa C z Arabidopsis thaliana: vztah struktury a funkce
|
detail
Nespecifická fosfolipasa C z Arabidopsis thaliana: vztah struktury a funkce
Lipidová signalizace se u rostlin stala jednou z hlavních signalizačních sítí jako adaptivní mechanismus v reakci na různé enviromentální vlivy. Fosfolipasy jsou enzymy, které zprostředkovávají přestavbu membránových lipidů, neboť katalyzují počáteční krok štěpení fosfolipidů a vytvářejí řadu druhých poslů odvozených od lipidů. Fosfolipasy C jsou důležitá skupina enzymů hydrolyzující lipidy jak u rostlin, tak i u živočichů. V genomu Arabidopsis thaliana bylo identifikováno šest isoforem fosfolipasy C, které si svou širokou substrátovou specifitou vysloužily pojmenování nespecifické fosfolipasy C – NPC. V této práci navazuji na předešlou diplomovou práci, kde za účelem objasnit vztah struktury a katalytické aktivity NPC4 v A. thaliana byly navrženy a vytvořeny mutace v okolí aktivního místa. Modifikované enzymy byly produkovány v kmenu Arctic Express E. coli nicméně jejich purifikace nebyla úspěšná. Pro lepší purifikaci byla vyzkoušena změna podmínek (pH), vliv detergentů ovšem bez významných výsledků. Možným vlivem v purifikačním procesu by mohla mít poměrně dlouhá aminokyselinová sekvence s His kotvou na N-konci proteinu, která je v blízkosti aktivního místa enzymu a proto vyštěpení této sekvence by mohlo vést k úspěšné purifikaci tohoto proteinu a následnému stanovení aktivity.
|
|
---
|
Bc.
Karolína
Zvonařová
|
M2
|
Ing. Markéta Častorálová, Ph.D.
|
Rekombinantní produkce matrixového proteinu viru Rousova sarkomu
|
detail
Rekombinantní produkce matrixového proteinu viru Rousova sarkomu
Virus Rousova sarkomu je retrovirus typu C, jež způsobuje sarkom u ptáků. V pozdní fázi jeho životního cyklu dochází k transportu polyproteinů Gag k vnitřní straně cytoplazmatické membrány, se kterou interagují. Tyto procesy jsou zprostředkovány matrixovým proteinem (MA), jež představuje N-terminální doménu polyproteinu Gag. Na rozdíl od většiny retrovirů není MA RSV N-terminálně myristoylován. Interakce s membránami je tedy zprostředkována pouze elektrostatickými interakcemi. Studium interakce MA s membránami, respektive pozorování vlivu dalších domén Gag na tuto interakci a také role této interakce na případné štěpení Gag virovou proteasou, by mělo přispět k bližšímu objasnění pozdní fáze životního cyklu RSV.
Cílem dosavadní práce bylo rekombinantně produkovat dvě varianty proteinu: samotný MA a MA s následujícími doménami p2 a p10 (MAP). Za tímto účelem byly z vektoru obsahujícího genom RSV amplifikovány příslušné nukleotidové sekvence pomocí metody PCR a použitím restrikčního štěpení byly vloženy do vektoru pET-22b (pelB-). Takto připravenými vektory byly transformovány bakteriální buňky Escherichia coli BL21(DE3) a BL21(DE3)-RIL, se kterými byla provedena zkušební produkce proteinů MA a MAP. Produkce ovšem nebyla úspěšná a nyní analyzujeme možné příčiny.
|
|
---
|
Bc.
Aneta
Machalíková
|
M2
|
Ing. Eva Benešová, Ph.D.
|
Fukosidasa z chladově-adaptovaného bakteriálního kmene C1-1
|
detail
Fukosidasa z chladově-adaptovaného bakteriálního kmene C1-1
α-L-Fukosidasy patří mezi enzymy z třídy hydrolas, konkrétně se jedná o glykosidasy. Katalyzují odštěpení L-fukosy z neredukujícího konce oligosacharidů nebo fukosylovaných konjugátů. V lidském organismu jsou důležité při mezibuněčných interakcích, imunitních reakcích, degradaci fukosylovaných konjugátů v lysozomu, při oplození vajíčka anebo výživě mikrobiomu. α-L-Fukosidasa z Arthrobacter sp. C1-1 se řadí do rodiny glykosidas GH29. Některé enzymy z této rodiny jednak hydrolyzují glykosidovou vazbu, jak bylo zmíněno výše, ale za určitých laboratorních podmínek katalyzují i reakce transglykosylační. Této schopnosti lze využít například při přípravě oligosacharidů mateřského mléka anebo terapeutik pro léčbu rakoviny. Arthrobacter sp. C1-1 je organismus adaptovaný na prostředí s trvale nízkou teplotou. Je tudíž možné, že i enzymy pocházející z tohoto organismu budou nízkým teplotám vhodně přizpůsobené a díky tomu průmyslově zajímavé. V rámci této diplomové práce byla úspěšně indukována syntéza α-L-fukosidasy v původním organismu Arthrobacter sp. C1-1 během kultivace v médiu obsahujícím L-fukosu. Dále byl enzym připraven rekombinantně v bakterii E. coli BL21 (DE3) a v následující práci se předpokládá charakterizace jeho hydrolytických a transglykosylačních vlastností.
|
|
---
|
Bc.
Petra
Tichá
|
M2
|
doc. Ing. Petra Lipovová, Ph.D.
|
Chladově aktivní amylasa z kvasinky Mrakiella aquatica
|
detail
Chladově aktivní amylasa z kvasinky Mrakiella aquatica
Biosféra Země je převážně chladná a trvale vystavena teplotám pod 5°C. Tak nízká průměrná teplota vyplývá hlavně ze skutečnosti, že většina povrchu Země je pokryta oceány. I přes silný negativní účinek nízkých teplot v těchto místech žijí organismy, které se svými vlastnostmi vyrovnávají organismům žijícím v mezofilních podmínkách. Tyto psychrofilní organismy produkují enzymy vykazující vyšší katalytickou aktivitu při nízké teplotě ve srovnání s jejich mezofilními protějšky. Jedním z potenciálně využitelných chladově aktivních enzymů je α-amylasa, která by našla uplatnění v mnoha průmyslových odvětvích.
Amylasy jsou enzymy ze třídy hydrolas, které štěpí α-1,4 glykosidickou vazbu makromolekul škrobu. Ve své práci se zabývám přípravou rekombinantní chladově aktivní α-amylasy pocházející z psychrofilní kvasinky Markiella aquatica. Dosud byl připraven vektor nesoucí gen pro α-amylasu, a ten byl následně transformován do kvasinky Saccharomyces cerevisiae. Enzym měl být produkován intracelulárně, ale identifikace pomocí metody western blot však nepotvrdila přítomnost tohoto enzymu. Proto byla do plasmidu přidána signální sekvence směřující produkci a-amylasy do extracelulárního prostoru. Po transformaci Saccharomyces cerevisiae bude stanovena amylasová aktivita v médiu.
|
|
---
|
Bc.
Tereza
Volfová
|
M2
|
Ing. Eva Benešová, Ph.D.
|
α-L-Fukosidasy mořské bakterie Microscilla sp. PRE1
|
detail
α-L-Fukosidasy mořské bakterie Microscilla sp. PRE1
α-L-Fukosidasy jsou enzymy z třídy hydrolas, které katalyzují odštěpování α-L-fukosylových zbytků z neredukujících konců oligosacharidů, glykoproteinů a glykolipidů. Za vhodných podmínek jsou některé α-L-fukosidasy schopny katalyzovat reakce, během kterých dochází k připojení α-L-fukosylového zbytku na různé akceptorové molekuly. Vzhledem k významu α-L-fukosylovaných molekul pro lidský organismus (fertilizace, buněčná adheze apod.) je tato vlastnost α-L-fukosidas často využívána pro syntézu L-fukosylovaných molekul, například oligosacharidů mateřského mléka, které přirozeně poskytují kojencům ochranu před mikrobiálními patogeny. Mořské prostředí představuje velký zdroj neprobádaného biologického materiálu včetně enzymů, které by mohly být díky svým vlastnostem využity v biotechnologiích nebo potravinářském průmyslu. O mořské bakterii Microscilla sp. PRE1 je známo, že obsahuje megaplasmid pSD15 (velikost 101 kbp), na kterém jsou přítomny dva různé geny kódující α-L-fukosidasy. Cílem experimentální části je ověřit možnost indukovat produkci těchto enzymů přímo ve studovaném organismu a zároveň se pokusit o jejich rekombinantní produkci v buňkách E. coli BL21 (DE3). V případě úspěšné produkce by byly charakterizovány jejich hydrolytické a transglykosylační schopnosti.
|
|
---
|
Bc.
Simona
Galádová
|
M2
|
doc. Ing. Vojtěch Spiwok, Ph.D.
|
Characterization of novel mutations in an RNA-cleaving deoxyribozyme
|
detail
Characterization of novel mutations in an RNA-cleaving deoxyribozyme
Deoxyribozymes are deoxyribonucleic acids with catalytic activity. One example is DVANACTKA, which was discovered using artificial evolution. DVANACTKA can cleave itself when a specific deoxyribonucleotide in the primary sequence is replaced by ribonucleotide. The secondary structure of DVANACTKA is similar to that of a deoxyribozyme called 8-17. One way to characterize DVANACTKA is based on its catalytic activity. This can be done by determining the percentage of cleaved deoxyribozyme. Divalent ions of lead, or magnesium are typically used as activators. Lead was used in these experiments since it is known to be important for both DVANACTKA and 8-17. Our results confirm that both deoxyribozymes are activated by lead. After 80 minutes 8-17 cleaved up to 72 % of present molecules and DVANACKA reached an even higher percentage – over 80 %. In a second approach, the 3D structure of DVANACTKA was modelled by SimRNA. The program is designed to create models of potential 3D structures of nucleic acids. The modelling was performed twice. One run was performed using only the primary sequence while the second used the known secondary structure of DVANACTKA as an input. The result predictions differ from one another depending on initial data.
|
|
---
|
Bc.
Blanka
Husťáková
|
M2
|
doc. Ing. Petra Lipovová, Ph.D.
|
Molekulární charakteristiky S1-P1 nukleas z lidských patogenů
|
detail
Molekulární charakteristiky S1-P1 nukleas z lidských patogenů
S1-P1 nukleasy jsou metaloenzymy se třemi ionty kovů v aktivním místě. Katalyzují štěpení nukleových kyselin, RNA i DNA, a většina z nich vykazuje preferenci pro jednořetězcové nukleové kyseliny (RNA, ssDNA) oproti dvouřetězcovým nukleovým kyselinám (dsDNA). Díky této vlastnosti našly některé z nich využití v biotechnologiích, či jsou studovány pro své protinádorové účinky.
Některé lidské patogeny, jako jsou bakterie Stenotrophomonas maltophilia, Legionella pneumophila nebo zástupci patogenních trypanosomatid, produkují S1-P1 nukleasy, zatímco u savců se tyto nukleasy nevyskytují. Studium těchto nukleas proto může přispět k novým terapeutickým postupům při léčbě infekcí způsobených multirezistentními kmeny.
Práce je zaměřena na S1-P1 nukleasu ze Stenotrophomonas maltophilia (SmNuc1), která je připravována rekombinantně v E. coli, s cílem charakterizovat její ezymatické vlastnosti a získat struktury komplexů SmNuc1 s ligandy podobnými nukleotidům. Pomocí rentgenové krystalografie byly vyřešeny struktury SmNuc1 s ligandy aciklovirem a favipiravirem v aktivním místě, které jsou potenciálními inhibitory SmNuc1. Zároveň dosavadní výsledky studie enzymatické aktivity naznačují, že SmNuc1 má vlastnosti vhodné pro některé biotechnologické aplikace.
|
