Studentská vědecká konference

Interakce signálního peptidu s částicí rozpoznávající signál (SRP) hraje velmi důležitou roli v cílení membránových a sekretovaných proteinů na membránu endoplazmatického retikula. Signální peptid lze rozlišit na tři oblasti, kdy jedna oblast je hydrofobní. V této oblasti byly nalezeny repetice hydrofobních aminokyselin u člověka a savců. Tato práce má za úkol charakterizovat interakci signálního peptidu a SRP simulacemi molekulové dynamiky a metadymiky. Pro studium byl vybrán receptor proteinu SRP54, a signální peptid interleukinu 17A obsahující leucinové repetice. Dalšími studovanými signálními peptidy byly dvě modifikace interleukinu 17A, kdy byl leucin nahrazen isoleucinem nebo valinem, a také ortolog s leucinovými a valinovými repeticemi. Nejdříve byly provedeny simulace molekulové dynamiky o délce 1 µs na strukturách receptoru SRP se signálním peptidem získaných pomocí molekulového dockingu. V průběhu simulací nedošlo k rozpadu struktur. Pouze signální peptid interleukinu 17A obohacen repeticemi leucinu vytvořil strukturu α-helix. Lze tedy říci, že signální peptidy obohacené repeticemi leucinu mohou tvořit funkční signální peptid. Výsledky získané simulacemi molekulové dynamiky jsou nadále v procesu ověřování jinou metodou, konkrétně metadynamikou.  

HEV32 je doména heveinu složená ze 32 aminokyselinových reziduí, schopná vytvářet komplex s chitinem. Je vhodná pro studium interakce protein-sacharid. V rámci této práce byla simulována interakce HEV32 s mono-, di- a trisacharidem odvozenými od chitinu; jako simulační metoda byla použita „nálevková“ metadynamika. Jako kolektivní proměnné, jejichž vzorkování bylo urychlováno pomocí metadynamiky, byly použity vzdálenost sacharidového ligandu od vazebného místa ve směru nálevky a proměnná vystihující konformační změny HEV32. Tato kolektivní proměnná byla získána pomocí analýzy hlavních komponent trajektorie simulace molekulové dynamiky systémů HEV32 s těmito sacharidy z práce publikované v článku Solanke et al (2019), Sci. Rep. 9, 18918. Byla provedena simulace každého ze tří popsaných systémů o délce 2 μs. Pomocí získaných ploch volné energie byly předpovězeny vazebné Gibbsovy energie ligandů, přičemž hodnota získaná pro trisacharid, -24 kJ/mol, odpovídala reálné hodnotě. V současnosti v práci pokračuji a snažím se získat lepší kolektivní proměnné vystihující konformační změny v HEV32.  

Anammoxní bakterie disponují velice specifickou vnitřní strukturou zvanou anammoxosom, jež je tvořena fosfolipidovou dvojvrstvou tvořenou estrery a etery ladderanů. Doposud nebylo zjištěno, jakým exaktním mechanismem jsou tyto vyšší mastné a cyklické kyseliny bakteriemi syntetizovány, ale na základě jejich vysoké spalné enthalpie mají potenciál pro využití v palivářském průmyslu; přesněji by se mohlo jednat o nové palivo pro raketové motory. Vystavení bakterií teplotnímu stresu, ve formě zvýšení teploty bioreaktoru, by mělo zvýšit produkci ladderanů. Při mé práci byla několikrát prováděna dezintegrace buněčné kultury obohacené o druh Candidatus Brocadia fulgida s následnou snahou o izolaci anammoxosomu pomocí sacharózové gradientové centrifugace. Výsledky byly pozorovány pomocí světelného mikroskopu a TEM. V další fázi práce bude snaha o extrakci cytosolických a transmembránových proteinů, kdy dalším krokem bude jejich identifikace pomocí hmotnostní spektroskopie (ESI-QTOF-MS). Výsledkem mé práce by mělo být nazelení enzymů, jež jsou zodpovědné za syntézu ladderanů.  

Escherichia coli je významná gramnegativní bakterie z čeledi Enterobacteriaceae. Je běžnou součástí střevního mikrobiomu teplokrevných zvířat včetně člověka, avšak může být i oportunním patogenem. E. coli je schopná tvořit silnou a odolnou vrstvu biofilmu (konsorcium buněk přichycených k sobě navzájem a k povrchu pomocí extracelulární matrice rezistentní k vnějším podmínkám) na abiotických i biotických površích. Tvorba biofilmu E. coli je tak velmi nežádoucím dějem především v nemocnicích (nozokomiální infekce), ale i v potravinářství (křížové kontaminace ve výrobě). Cílem této práce je přispět k objasnění mechanismu působení antimikrobiálních látek na transkripci genů regulujících stresovou odpověď včetně tvorby biofilmu. Testování je prováděno u tří kmenů E. coli a zlatých nanočástic v subletální koncentraci. V první části práce byl testován vliv těchto AuNPs na životaschopnost a tvorbu biofilmu u planktonních buněk. Ve druhé části práce byla provedena izolace mRNA z kultur E. coli rostoucích v přítomnosti a nepřítomnosti AuNPs. Pro stanovení míry transkripce byly vybrány cílové geny rpoS a oxyR, jako referenční geny byly vybrány 16S rRNA a gapA. Pro amplifikaci těchto genů byla zavedena metoda qPCR, která bude dále využita pro relativní kvantifikaci počtu jejich kopií v cDNA.  

Rostlinné nespecifické nukleasy, zejména z rodiny nukleasa I, mají potenciál jako protinádorová terapeutika. Patří mezi ně i nukleasa TBN1 z rajčete jedlého, u které byl prokázán antiproliferační účinek na kožní melanom a karcinom prostaty při laboratorních testech na myších. Zároveň u ní byly zjištěny nižší nežádoucí účinky než u ostatních zkoumaných rostlinných nukleas. Problém nukleasy TBN1 je s jejím nízkým výtěžkem při produkci v rostlinách a vyšší houby, jako eukaryotické organismy, by mohly být vhodným produkčním systémem. Proto je tato práce zaměřena na transformaci saprotrofní houby Polyporus ciliatus genem pro TBN1 pomocí bakterie Agrobacterium tumefaciens. Zároveň je cílem této práce potvrdit přítomnost genu pro nukleasu TBN1 v již potenciálně transformované houbě Coprinellus bisporus. Pro optimalizaci procesu transformace houby P. ciliatus byla zjištěna vhodná koncentrace acetosyringonu a pro úspěšnou selekci pozitivních transformantů byly zjištěny vhodné koncentrace antibiotik hygromycinu, cefotaximu a carbenicillinu. Druhý z probíhajících experimentů, tedy potvrzení přítomnosti genu pro nukleasu TBN1 v již potenciálně transformované houbě C. bisporus, byl započat odstraňováním přebytečné bakterie A. tumefaciens, která po transformaci kontaminuje houbové mycelium.  

Masonův-Pfizerův opičí virus (M-PMV) je retrovirus typu B/D, u kterého jsou časově i prostorově odděleny procesy skládání virové částice (v cytoplazmě hostitele) a transport k cytoplazmatické membráně s následným pučením. Matrixový protein (MA) je jeden ze strukturních proteinů virové částice. Pomocí myristoylu na svém N-konci a kladně nabitých aminokyselin v silně bazické oblasti (HBR, z angl. „high basic region“) interaguje s membránami, což umožňuje regulaci transportu a pučení virové částice ven z buňky. U M-PMV aminokyselinové záměny lysinů HBR v pozicích 16 a 20 za alanin způsobily pučení do intracelulárních vezikul. V případě HIV-1, jehož matrixový protein je funkčně i strukturně podobný MA M-PMV, byla popsána interakce MA s tRNA, která brání nespecifické interakci s jinými membránami než cytoplasmatickou. Vzhledem ke zmíněné podobnosti lze uvažovat, že ke stejné regulaci dochází i u M-PMV. Za účelem ověření této hypotézy byl rekombinantně připraven nativní MA M-PMV a MA s aminokyselinovými záměnami v pozicích 16 a 20. Potenciální interakce připravených matrixových proteinů s tRNA byla studována pomocí gelové retardační analýzy (z angl. „electroforetic mobility shift assay“ - EMSA) a pomocí termoforézy v mikroměřítku.

Ektomykorhizní houba Russula atropurpurea je významným hyperakumulátorem zinku (plodnice obsahují až 1 067 mg Zn na kg sušiny). Bylo zjištěno, že peptidovými ligandy přebytku Zn v plodnicích jsou isomorfní peptidy RaZBP1 a RaZBP2. Tyto peptidy jsou schopné vázat téměř 80 % Zn extrahovaného z plodnic této houby, pravděpodobně ji chrání proti toxicitě Zn a vykazují pouze omezenou sekvenční podobnost se známými metalothioneiny vzhledem k absenci více motivů C-X-C (X je jakákoliv aminokyselina kromě prolinu). Přítomnost těchto peptidů byla později potvrzena i u dalších akumulátorů Zn z rodu Russula. Zdá se tedy, že druhy Russula akumulující Zn používají zcela specifickou strategii manipulace se Zn, odlišnou od ostatních studovaných hub. Cílem práce je ověřit vazbu Zn²⁺ na peptid RaZBP1 a určit disociační konstantu (K_d) této reakce pomocí termoforézy. Během měření bylo zjištěno, že v použitých pufrech vzniká nerozpustný Zn(OH)₂. Naměřená hodnota K_d tak může být ovlivněna vysrážením Zn. Do budoucna se tedy plánuje nové měření v pufrech MOPSO a EPPS, ve kterých by podle dostupné literatury nemělo ke vzniku Zn(OH)₂ docházet. Dalším cílem poté bude exprese metalothioneinů R. atropurpurea RaMT1 a RaMT2, změření jejich K_d pomocí termoforézy a srovnání jejich afinit k Zn s afinitou RaZBP1.

Celiakie je imunopatologické onemocnění s dlouhou asymptomatickou periodou (obdobím, kdy je detekovatelné zejména imunologickými markery), s jehož prvními projevy se setkáváme zejména v dětském věku. Celiakie vzniká v důsledku expozice glutenu z potravy u jedinců s genetickými predispozicemi (především jsou to geny kódující HLA-DQ2 a HLA-DQ8). Jedinců s tímto genetickým rizikem, kteří neomezeně konzumují gluten bez jakýchkoli komplikací, je řádově více než nemocných. Z toho lze usuzovat na existenci dalších, zejména negenetických spouštěčů či akcelerátorů imunopatologického procesu. Dobrými kandidáty se zdají být viry, zejména pak enteroviry, ale tato skupina virů nemusí být jediná. V rámci práce se zaměřuji na studium celkového složení DNA viromu (množiny všech virů) ve vzorcích stolice z kohorty dětí s homogenně vysokým genetickým rizikem vzniku celiakie. Pracuji s nukleovou kyselinou izolovanou ze supernatantu stolic, kterou používám pro přípravu metagenomických knihoven. Knihovny jsou následně sekvenovány metodou sekvenování nové generace na platformě Illumina. Doposud jsem se podílela na přípravě a sekvenaci 661 knihoven. Po sekvenaci a bioinformatické analýze sekvencí bude výskyt virů a jejich motivů porovnán mezi jedinci s celiakální autoimunitou a bez ní.