Studentská vědecká konference

Arsen (As) je polokovový prvek, na který si organismy z důvodu jeho toxicity a toxicity jeho sloučenin musely vytvořit speciální metabolické dráhy pro jeho detoxifikaci. Jednou z takových drah je methylace As, která byla popsána napříč všemi říšemi. U vyšších hub však zůstává tento jev stále neprozkoumán, ačkoliv přítomnost methylovaných sloučenin As byla již u vyšších hub potvrzena. Doposud není stále objasněno, zda methylaci provádí houba samotná, nebo zda jí tuto funkci zajišťují symbiotické bakterie. Bylo zjištěno, že potřebné geny pro methylaci As se pravděpodobně rozšířily mezi ostatní organismy horizontálním přenosem genů z bakterií, u kterých bývají tyto geny často seskupeny v takzvaném ars operonu. Je tedy možné předpokládat, že i u vyšších hub by se mohlo jednat o podobný fenomén. Ze dvou druhů rodu Hebeloma se podařilo získat částečné sekvence arsen methyltransferasy a transportéru As ACR3 ležících na rozdílných lokusech. Následně byla zkonstruována tzv. „GenomeWalking“ knihovna, která umožnuje bez znalosti genomu daného organismu určit sekvenci DNA celého genu a jeho okolí. V následujícím postupu budou provedeny funkční studie těchto genů v Saccharomyces cerevisiae a v případě transportéru ACR3 bude ve fúzi se zeleným fluorescenčním proteinem určena jeho lokalizace.  

Ryby z čeledi lososovití (Salmonidae) a jejich produkty představují stěžejní pilíř v oblasti potravinářství. V současném globálním světě je vytvářen enormní tlak ze strany poptávky na tuto čeleď ryb. S tímto zvětšujícím se trendem dochází k nárůstu případů falšování či nesprávného označení jednotlivých druhů ryb z čeledi Salmonidae. Z této tendence vyplývá, že simultánně přibývají případy nežádoucích otrav a alergických reakcí vůči parvalbuminu po požití chybně označeného jedince. Toto jsou pádné důvody pro vytvoření vhodných metodik a nástrojů sloužících ke skupinové identifikaci, potažmo druhové identifikaci. Cílem této práce byl návrh vhodných primerů pro identifikaci vybraných zástupců z čeledi Salmonidae, K testování účinnosti navržených primerů byla využita kvantitativní polymerázová řetězová reakce (qPCR). Jako oblast identifikace byla zvolena intronová část parvalbuminového genu, především se jedná o první a druhý intron. Součástí experimentální části byla též izolace DNA a měření kvality izolace DNA pomocí spektrofotometru. Navazujícím cílem jest návrh a testování vhodně značené sondy pro vybrané zástupce ryb z čeledi Salmonidae, konkrétně lososa obecného (Salmo salar) a pstruha duhového (Oncorhynchus mykiss).  Práce byla finančně podpořena z grantu MZe (NAZV) QK1910231.  

Identifikace osob na základě profilování krátkých tandemových repetic (STR) se v kriminalistické praxi používá již řadu let. Při podpisu papírového dokumentu se většina osob opírá o malíkovou hranu dlaně a zanechává tak na papíru kožní buňky. Cílem této práce je ověřit hypotézu, že je možno z oblasti podpisového řádku papírového nosiče získat dostatečné množství DNA pro STR profilování. K izolaci byla použita komerční souprava Casework Direct System, která je určena pro vzorky s minimálním množstvím DNA, následná multiplex amplifikace byla provedena pomocí soupravy PowerPlex® Fusion 6C System. Fragmentační analýza byla realizována přístrojem SeqStudio, vyhodnocení pomocí software GeneMapper ID-X.  

O vyšších houbách je známo, že jsou schopny akumulovat ve svých plodnicích vysoké koncentrace těžkých kovů. Hyperakumulace kadmia (Cd) však byla doposud popsána pouze u dvou druhů saprotrofních hub Cystoderma carcharias a Agaricus crocodilinus. Cílem této práce bylo zjistit genetické a biologické aspekty vedoucí u houby A. crocodilinus ke schopnosti hyperakumulace Cd. Zaměřili jsme se na identifikaci a charakterizaci genů CDF (z angl. Cation Diffusion Facilitator) proteinových transportérů, které jsou zodpovědné za transport dvoumocných iontů kovů. Byly získány nukleotidové sekvence dvou transportérů označené AcCDF1 a AcCDF2. Fylogenetická analýza umístila AcCDF1 do zinkového CDF klastru, zatímco AcCDF2 byl zařazen do zcela nové, zatím nedefinované skupiny CDF transportérů. Pomocí softwaru využívající neuronovou síť AlphaFold byly predikovány jejich trojrozměrné struktury a určeny aminokyselinové zbytky zodpovědné za transport kovu. V mutantních kmenech Saccharomyces cerevisiae byla u AcCDF1 zjištěna jeho substrátová specifita a díky fúzi se zeleným fluorescenčním proteinem určena také jeho lokalizace. Ze znalosti struktury AcCDF1 se dále pokusíme řízenou mutagenezí změnit jeho specifitu. Získané poznatky mohou být v budoucnu využity při potenciálních bioremediačních procesech.  

Alergie na ryby patří mezi nejčastěji se vyskytující potravinové alergie. Hlavní alergen rybího masa je svalový protein parvalbumin. Ten může být použit jako identifikační marker nejen pro analýzu syrových ryb, díky jeho odolnosti rovněž i pro analýzy zpracovaných a tepelně upravených rybích výrobků. Toho může být využito při průkazu falšování rybích produktů, které jsou jednou z nejčastěji falšovaných komodit díky své oblíbenosti mezi konzumenty. Aby nedocházelo ke klamání spotřebitelů, ale i ohrožování jejich zdraví, je zapotřebí navrhnout rychlé a specifické metody pro druhovou identifikaci ryb. Cílem této práce bylo navrhnout protokol pro izotermickou amplifikaci DNA štiky obecné (Esox lucius) s využitím metody LAMP (z angl. Loop-mediated isothermal amplification). Za tímto účelem byly navrženy specifické primery v oblasti intronu parvalbuminového genu. Metoda byla zkoušena za použití různých reakčních mixů a byla provedena optimalizace reakčních podmínek vhodných pro detekci štiky obecné. Po optimalizaci podmínek byla navržená metoda testována na panelu 13 druhů ryb. Práce byla finančně podpořena z grantu MZe (NAZV) QK1910231.  

Práce se zabývá problematikou izolace DNA z papírových dokumentů, zejména izolace z oblasti podpisových řádků. V této oblasti se většina populace při podpisu opírá malíkovou hranou dlaně, je tedy vysoká pravděpodobnost, že na papíře zůstanou biologické stopy signatáře. Cílem práce je prokázat přítomnost těchto stop a kvantifikovat množství izolované DNA. Izolaci provádíme pomocí komerční soupravy Casework Direct System. Tato souprava minimalizuje ztráty, jelikož se vzorek nepromývá. Je proto vhodná pro vzorky s nízkou koncentrací DNA. Izolovanou DNA následně kvantifikujeme pomocí dPCR. Pro srovnání a verifikaci získaného výsledku izoláty kvantifikujeme také prostřednictvím qPCR s využitím soupravy Plexor HY System. Následně jsme se z izolátů pomocí soupravy PowerPlex Fusion 6C Systém pokusili získat STR profil. Průběžné výsledky poukazují na problémy při izolaci, jelikož se nám prozatím nepodařilo úspěšně kvantifikovat množství získané DNA, ani získat kvalitní STR profil. Z vyzkoušených metod izolace se zatím ukázalo, že při navlhčení papíru jsme schopni získat větší množství DNA. Výsledkem této práce bude sestavení postupu izolace pro dosažení nejvyššího možného výtěžku a porovnání dPCR a qPCR metod. 

Validace qPCR protokolů pro kvantifikaci genů kódujících rezistenci k antibiotikům Bc. Kateřina Hanáková Školitel: Ing. Sabina Purkrtová, Ph.D. Antibiotika jsou zásadními látkami pro léčbu bakteriálních infekcí. Bakterie jsou však schopny si vůči nim vyvinout obranné mechanismy rezistence, což následně způsobuje zhoršení léčby i banálních bakteriálních infekcí. Geny rezistence k antibiotikům (ARG), kódující tyto mechanismy, jsou součástí nejen chromozomů, ale zvláště mobilních genetických elementů. Cílem této práce je zavedení a validace qPCR protokolů pro absolutní i relativní kvantifikaci vybraných ARG. V rámci testování jsou použity vzorky DNA izolované z různých částí ČOV (anaerobní a aktivovaný kal, odpadní voda) v rámci kruhového testu v projektu REPARES (H2020-EU.4.b. ID 857552). Cílem práce je zjistit vliv jednotlivých faktorů (vliv přístroje, teploty nasedání, metody měření koncentrací atd.) qPCR protokolů na absolutní qPCR kvantifikaci počtu kopií vybraných ARG pomocí gBlock^TM (až 3000 párů bazí dlouhé fragmenty dsDNA externě dodávané) s cílem zavést spolehlivý a validovaný protokol. Byly testovány qPCR protokoly pro absolutní kvantifikaci ARG tetO (rezistence k tetracyklinu), sul1 (rezistence k sulfonamidům), genu pro integrázu (int1) a referenčního genu pro 16S rRNA.

Nanopórová technologie sekvenace DNA je řazena mezi metody dlouhého čtení, což představuje výhodu zejména z hlediska jednoduššího skládání fragmentů DNA do delších celků. Ve srovnání s metodami krátkého čtení jsou totiž u této sekvenační technologie fragmenty obvykle 100krát delší. To se ovšem děje na úkor nižší přesnosti v detekci jednotlivých bází. Chyby jsou zde zejména v podobě inzercí a delecí (indelů) vznikajících v místech homopolymerních sekvencí. Ty pak ve výsledném genomu způsobují posun čtecího rámce, inserci stop-kodonu do kódující sekvence, nebo naopak jeho zrušení, což dává vzniknou tzv. pseudogenům. Počet těchto pseudogenů je možné snížit díky polishingu za využití softwarů umožňujících najít a opravit sekvenační chyby.  Cílem této práce je nalézt takovou kombinaci bioinformatických nástrojů umožňujících assembly (Canu, Flye) a polishing (Medaka, Racon), aby se počet pseudogenů co nejvíce snížil, tedy aby se zvýšila kvalita výsledného genomu. K monitoringu počtu pseudogenů (před i po průběhu polishingu) byl používán PGAP – anotační software od NCBI.