Studentská vědecká konference

Klastry s jádrem [Mo₆I₈]⁴⁺ produkují singletový kyslík po expozici širokému spektru záření včetně modrého světla a rentgenových paprsků. Jejich biokompatibilita a nízká toxicita slibují využití ve fotodynamické a rentgenem indukované fotodynamické terapii rakovinných buněk. V této práci se zabývám biologickým testováním čtyř formulací klastrů zahrnujících molekulární klastr, nanočástice, polymerní částice a lipidem stabilizované nanočástice. Tyto formulace vykazují vysoký fototoxický účinek po ozáření modrým světlem (460 nm) s IC₅₀ v rozmezí 0,04 – 16,6 μmol.l^-1 přičemž ve tmě se žádná toxicita neprojevuje. V případě nanočástic pozorujeme i signifikantní synergii s rentgenovým zářením při inhibici proliferace buněk již při dávce 2 Gy. K testování byly využity i 3D buněčné sféroidy, čímž se přibližujeme podmínkám lidského těla, např. gradientu kyslíku směrem k nekrotickému jádru. Po ovlivnění sféroidů částicemi a ozáření pozorujeme zastavení růstu sféroidů a snížení metabolické aktivity. Naše práce ukázala, že různé formulace molybdenových klastrů jsou slibným základem pro vývoj protinádorových terapeutik působících na bázi fotodynamické terapie.

Léky na léčbu erektilní dysfunkce patří nepochybně mezi nejvíce padělaná léčiva na světě. Přestože se jedná o rozsáhlý problém, tak se mu nevěnuje dostatečná pozornost. Při analýze falsifikátů je důležité používat metody se specifickými vlastnostmi. Jedná se o nedestruktivnost, jednoduchou přípravu vzorku, relativně malé množství vzorku potřebné k analýze, přímočaré vyhodnocení výsledků, rychlost metody a nižší náročnost na obsluhující personál. Tyto podmínky splňuje především rentgenová prášková difrakce (XRPD). Pokud XRPD doplníme o Ramanovu a infračervenou spektroskopii, tak získáme spolehlivé informace o vnitřním složení přípravku. Cílem práce je ověřit použití metody rentgenové práškové difrakce, Ramanovy a infračervené spektroskopie ke kvalitativní analýze padělaných medicinálních přípravků s obsahem inhibitorů fosfodiesterázy 5 a rozšířit tak možnosti forenzní identifikace padělaných léků.

Cílem projektu je studovat vliv adhezních GPCRs na infekci Calu-3 buněk viry způsobujícími respirační onemocnění, konkrétně virem chřipky typu A a SARS-CoV-2. Za tímto účelem bylo nejprve třeba ověřit, zda jsou Calu-3 buňky těmito viry infikovatelné a najít vhodné podmínky pro infekci. Infekce byla potvrzena pomocí imunofluorescenčního stanovení virových antigenů. Pomocí XTT eseje byl sledován cytopatický efekt, na jehož základě byly vybrány podmínky, které umožňují úspěšnou infekci. Zmíněnými metodami se nám podařilo prokázat, že Calu-3 buňky, odvozené od adenokarcinomu lidských plicních epiteliálních buněk, jsou infikovatelné jak virem chřipky typu A, tak SARS-CoV-2. Dále bylo třeba určit, zda dochází ke změně exprese adhezních GPCRs po infekci studovaných buněk respiračními viry a zda se tedy tyto receptory podílí na infekci. Pro analýzu změn exprese daných proteinů byla izolovaná celková buněčná RNA, která byla analyzována pomocí RTqPCR s primery proti úsekům kódujícím adhezní GPCRs a proti proteinům v jejich signalizačních drahách. Pomocí RTqPCR byla sledována změna exprese těchto proteinů mezi infikovanými a neinfikovanými buňkami v čase 6 a 24 hodin po infekci.

Autosomálně dominantní tubulointersticiální nefropatie (ADTKD) je pomalu progredující dědičné onemocnění ledvin vyžadující dialýzu a transplantaci ledvin ve věku 30. – 70. let. V současnosti jsou známy 4 geny podmiňující ADTKD, stále však zůstává asi 35 % případů s neobjasněnou genetickou příčinou. Hlavním patogenetickým mechanismem vedoucím k selhání ledvin u ADTKD pacientů je hromadění mutovaných proteinů v buňkách ledvin.  V rámci této práce jsme v rodině s fenotypem ADTKD a vyloučenými mutacemi ve známých kauzálních genech identifikovali heterozygotní variantu v genu LAMA5 (c.5621G>A, p.D1852N), jež plně segreguje s onemocněním. Na úrovni pacientské střevní biopsie jsme detekovali aberantní expresi LAMA5 ve srovnání s kontrolní tkání. V rámci studia funkčního dopadu varianty D1852N-LAMA5 jsme pomocí technologie CRISPR-Cas9 vytvořili buněčné linie savčích buněk produkujících mutovaný a WT protein LAMA5. Tento buněčný model následně využijeme pro analýzu posttranslačních modifikací (western blot) a lokalizaci LAMA5 v relevantních buněčných kompartmentech (imunocytochemie, konfokální mikroskopie). Výsledky získané z buněčného modelu a střevní tkáně od pacienta s variantou v LAMA5 by měly přispět k objasnění molekulárního mechanismu vedoucího k selhání ledvin v dané rodině.  

Nikotinamidfosforibosyltransferasa (Nampt) je klíčový enzym biosyntetické dráhy NAD vycházející z nikotinamidu. NAD působí jako koenzym v mnoha redoxních reakcích, které se mohou podílet také v ochraně buňky proti oxidačnímu stresu. V situaci, kdy antioxidační ochrana selhává, dochází k hromadění volných radikálů a nastává oxidační stres. Naším cílem je zjistit, zda se Nampt svou enzymatickou aktivitou, tedy produkcí NAD, podílí na ochraně buňky proti oxidačnímu stresu. V rámci studie pracujeme s buněčnou linií preadipocytů 3T3-L1. Jako induktor oxidačního stresu jsme zvolili peroxid vodíku, s nímž byly buňky ovlivněny po dobu 4 a 24 hodin. Nejprve jsme stanovili buněčnou viabilitu, kdy jsme pozorovali pokles v životaschopnosti buněk v závislosti na koncentraci peroxidu vodíku. Jako střední letální dávku peroxidu vodíku (LD₅₀) jsme určili koncentraci 851 µmol∙l^‑1 pro 4-hodinovou inkubaci a 677 µmol∙l^‑1 pro 24-hodinovou inkubaci. Dále jsme se zaměřili na určení vhodného množství preadipocytů pro stanovení antioxidační kapacity, kdy jsme jako dostačující počet stanovili 8∙10⁵ buněk.  

Schistosomóza je onemocnění, které vyvolává motolice rodu Schistosoma. Schistosomóza se řadí mezi tzv. zanedbávaná tropická onemocnění, pro která je typické, že navzdory jejich celosvětovému obrovskému počtu nakažených se jim nevěnuje adekvátní pozornost. Pozornosti se schistosomóze nedostává, kvůli jejímu rozšíření v oblastech světa s nízkou životní úrovní. Podle světové zdravotnické organizace se schistosomózou za rok 2019 nakazilo 240 miliónů lidí a dalších přibližně 700 miliónů lidí žijí v endemických oblastech, kde jsou každodenně vystaveni vysokému riziku nákazy. Proti tomuto onemocnění je dosud používáno jediné antischistosomální léčivo zvané praziquantel. Na praziquantel vzniká rezistence, a proto je snaha nalézt léčivo nové. Pro schistosomózu také stále chybí specifické biomarkery, podle nichž by bylo možné přesněji určit v jaké fázi onemocnění se nakažený jedinec nachází. Protože je schistosomóza komplexní onemocnění postihující mnoho orgánů naráz není dostačující pro vyhodnocení úspěšnosti terapie pouze jeden vybraný marker. Cílem této diplomové práce je navrhnout potenciální biomarkery závažnosti probíhající experimentální schistosomózy u myší nakažené S. mansoni. Dalším cílem je testování účinku nových inhibitorů proteáz S. mansoni jakožto potenciálního léčiva.

Hlavním úkolem hemostázy je zástava krvácení v porušeném krevním řečišti a současně obnova normální cirkulace v poraněné cévě. Při poškození cévní stěny okamžitě nastoupí hemostatické procesy, které postupně vedou k jejímu uzavření. Finálním krokem koagulační kaskády je přeměna fibrinogenu na fibrin působením serinové proteázy trombinu a vytvoření fibrinové sítě. Porucha jakékoliv ze složek hemostázy může vést k závažným krvácivým či trombotickým stavům. Cílem této práce je studium interakce fibrinogenu a trombinu, posouzení morfologie vzniklého fibrinového klotu a vývoj metody pro měření jeho biomechanických vlastností u plasem s deficiencí koagulačních faktorů FVIII, FIX a FXI a u pacientů s poruchou hemostázy. Doposud byla provedena měření polymeračních a fibrinolytických křivek u vzorků 35 pacientů trpících vrozenými poruchami fibrinogenu pomocí turbidimetrické metody. Měření budou v další fázi výzkumu doplněna snímky z elektronového skenovacího mikroskopu a reometrickým měřením biomechanických vlastností koagulace. Jednotlivé studované parametry nám pomohou získat ucelený pohled na kvalitu fibrinového klotu pro dané konkrétní onemocnění a propojit klinický fenotyp pacienta s výsledky měření.

Nikotinamidfosforibosyltransferasa (Nampt) je intracelulární enzym, který se primárně účastní biosyntézy NAD. Bývá rovněž uváděno, že v extracelulárním prostředí působí jako cytokin. V současné době ale není znám přesný sekreční mechanismus a ani nejsou popsány buňky sekretující Nampt. Zvýšené hladiny Nampt však byly nalezeny v krvi pacientů trpících chronickými a zánětlivými onemocněními, jako je obezita nebo rakovina. Proto bývají za buňky sekretující Nampt označovány rakovinné buňky, adipocyty nebo buňky imunitního systému. Naším cílem bylo ověřit aktivní sekreci Nampt na rakovinných liniích i) pankreatu: PaTu a MIA PaCa-2; ii) jater: HepG2; iii) střevní sliznice: CaCo-2 a HT-29; iv) kosti: U-2 OS a v) mozku: SH-SY5Y. Metodou imunoblotu byla posouzena aktivní sekrece Nampt, kdy jsme stanovili množství Nampt a intracelulárního enzymu glyceraldehyd-3-fosfátdehydrogenasy (GAPDH) v kultivačním médiu a buněčném lyzátu. Za aktivní sekreci Nampt byl označen výsledek, kdy bylo zjištěno vyšší množství Nampt/GAPDH v kultivačním médiu, nežli v buněčném lyzátu. Všechny použité rakovinné linie aktivně sekretovaly Nampt, přičemž nejvyšší míru sekrece vykazovaly linie střevní sliznice HT-29 a kosti U-2 OS.