Studentská vědecká konference

Chemická povaha 5´konce RNA je klíčovou determinantou stability RNA, jejího zpracování, lokalizace a v případě mRNA i účinnosti její translace. Dlouho se předpokládalo, že pouze eukaryota chrání svou RNA čepičkou, tzv. m⁷G. Později se ukázalo, že i prokaryota využívají určitý druh ochrany své RNA například ve formě 5 ́trifosfátu (ppp-RNA) nebo nikotinamiddinukleotidu kovalentně připojeného k 5 ́konci. Nedávno byla objevena zcela nová třída RNA čepiček v bakteriích – dinukleosid polyfosfáty (Np_nN), avšak sekvence RNA, které jsou takto čepičkované i jejich role v buňkách je zatím neznámá. Cílem této práce je vyvinout metodu pro studium interakcí Np_nN-RNA s proteiny. K tomu jsem využila bio-layer interferometrii – metodu využívající analýzu interferenčního obrazce bílého světla, které se odráží od vrstvy biomolekul imobilizovaných na povrchu hrotu biosenzoru. Změna v interferenčním obrazci je vyvolána jakoukoli změnou v počtu molekul spojených s hrotem biosenzoru. Připravila jsem modelové čepičkované RNA a použila bio-layer interferometrii ke studiu jejich interakcí s proteiny. Prozatím jsem zjistila ideální podmínky měření a kvantifikovala interakci proteinu HINT1 s ppp-RNA  a Ap₄A-RNA a porovnala síly interakce.  

Salmo salar, běžně známý jako losos atlantský, patří k jedné z nejoblíbenějších živočišných komodit, zejména pro svou jedinečnou chuť a nutriční vlastnosti. Nicméně kvůli vysoké poptávce na trhu se Salmo salar stává častým předmětem falšování a bývá nahrazován levnějším a také dostupnějším Oncorhynchus mykiss neboli pstruhem duhovým. K této záměně dochází kvůli morfologické podobnosti těchto dvou druhů, pro spotřebitele je tedy takřka nemožné je rozlišit, hlavně ve výrobcích. Problémem však není pouze klamání spotřebitele. Komplikací je i zdravotní nebezpečnost těchto falšovaných potravin, kdy jedno z možných rizik představuje vysoká alergenicita parvalbuminu. Proto je zcela nezbytné vytvořit vhodnou a specifickou metodu k druhové identifikaci ryb. Tato práce je zaměřena na návrh a experimentální ověření protokolu pro DNA barcoding a DNA mini-barcoding vybraných druhů ryb. Jak pro DNA barcoding, tak i pro DNA mini-barcoding byl jako oblast identifikace použit mitochondriální gen podjednotky I cytochrom c oxidasy (COI). Dalším dílem experimentální části byla izolace DNA pomocí metody CTAB a následné ověření kvality a kvantity takto izolované DNA za použití spektrofotometru, fluorimetru, qPCR a Sangerova sekvenování. Práce byla finančně podpořena z grantu MZe (NAZV) QK1910231.

Štika obecná (Esox lucius) je považována za předního predátora okupujícího sladkovodní a poloslaná území. Je to masožravá ryba, která dává přednost samotářskému stylu života. Významná je z hospodářského hlediska a také například ve sportovním rybolovu. Se stále se zvyšující poptávkou mezinárodního trhu s rybami roste na důležitosti schopnost identifikace původu již zpracovaných rybích výrobků a obsahu jednotlivých druhů rybího masa ve zmíněných výrobcích. Cílem práce je ověřit možnosti izolace DNA štiky ze svaloviny různými metodami (CTAB, DNeasy® mericon Food Kit a croBEE® 201A Nucleic Acid Extraction Kit) a najít způsob, ze kterého by byl co největší výtěžek DNA. Koncentrace DNA byla měřena spektrofotometricky nebo fluorimetricky. Následně byla DNA testována pomocí qPCR s primery amplifikujícími parvalbuminový gen. Další práce bude zahrnovat přípravu vícedruhových směsí svalovin ryb, izolaci jejich DNA a provedení analýzy pomocí qPCR. Také se budou ověřovat experimentální podmínky LAMP protokolu, který by byl vhodný pro identifikaci štiky obecné v reálném čase. Výzkum je zaměřen na specifické rozpoznání masa štiky obecné v různých vzorcích ryb a jeho odlišení od jiných druhů rybího masa. Tato práce byla finančně podpořena z grantu MZe (NAZV) QK1910231.

Bylo pozorováno, že vyšší houby mohou ve svých plodnicích akumulovat pozoruhodně vysoké koncentrace kadmia. Mezi tyto významné akumulátory se řadí houby Amanita muscaria, Agaricus crocodillinus a Cystoderma carcharias. Cílem této práce bylo izolovat a charakterizovat geny těchto hub odpovědné za akumulaci kadmia. Pro identifikaci genů byla u každé z hub vybrána jiná metodika. Konkrétně šlo o in silico analýzy genomu houby A. muscaria, konstrukci expresní knihovny u houby A. crocodillinus a in vitro knockout abundantních genů z již připravené expresní knihovny houby C. carcharias pomocí systému CRISPR/Cas9. Pomocí prvních dvou metod se podařilo identifikovat celkem tři různé geny kódující metalothioneiny: gen AmMT1 z houby A. muscaria a geny AcMT1 a AcMT2 z houby A. crocodillinus. Všechny identifikované geny byly následně charakterizovány v mutantních kmenech kvasinek Saccharomyces cerevisiae. Získané sekvence metalothioneinů byly dále porovnány s dostupnými sekvencemi houbových metalothioneinů ze třídy Agaricomycetes a zařazeny do klasifikačních skupin. Třetí metodou byly z cDNA knihovny C. carcharias odstraněny abundantní plasmidy nesoucí geny CcMT1 a CcMT2, tento krok by mohl přispět k objevení nových genů odpovědných za akumulaci kadmia.  

Arsen (As) je toxický prvek, jehož akumulace v plodnicích jedlých hub, většinou ve formě methylesterů arsenitých a arseničných kyselin, představuje možné zdravotní riziko pro konzumenty. Přestože methylované formy As jsou v houbách nalézány relativně často, jejich původ není jednoznačně vysvětlen. Jeden z možných zdrojů je absorpce těchto sloučenin houbou z půdy, kde se nachází bakteriální společenství, vytvářející methylované formy tohoto polokovu. Schopnost methylace As u půdních bakterií lze ověřit pomocí zjištění přítomnosti genu arsM, součásti tzv. «arsenomu», kódujícího arsenit-methyltransferasu. Pro tuto analýzu je potřeba univerzální funkční sada primerů, jejíž nalezení a testování je hlavním cílem této práce.  Primery nalezené v literatuře pro izolaci arsM, které byly také zařazeny do testování, podle dalších studií podceňují diverzitu tohoto genu, proto bylo rozhodnuto navrhnout vlastní sadu. Návrh primerů byl proveden dvěma způsoby: ručně, s rozdělením známých proteinových sekvencí arsM do fylogenetických klastrů, a pomocí softwaru HYDEN. Primery jsou testovány in silico a in vitro na genomové DNA arsM pozitivních bakterií. Amplikony budou sekvenovány pro upřesnění jejich identity. Sady primerů budou testovány také na reálných půdních vzorcích.  

Chitooligosacharidy (COS) jsou homo či heterooligomery složené z jednotek D-glukosaminu a/nebo N‑acetyl-D-glukosaminu a pro své mnohé prospěšné účinky (např. snižování hladiny cholesterolu) se spolu s chitosanem stávají oblíbeným doplňkem stravy. COS se vyrábějí enzymatickou, fyzikální nebo chemickou depolymerizací chitinu či chitosanu, po které nejčastěji následuje chromatografická či membránová separace produktů z reakční směsi. V současnosti je nejobtížnějším krokem získání COS o definované čistotě, stupni polymerace a acetylace. Pro získání analytických standardů je tedy důležité zavést jednoduché, laboratorně dostupné a pokud možno levné metody hydrolýzy, separace, detekce a následné charakterizace COS. Jako nejvhodnější se jeví spojení chemické hydrolýzy následované iontově výměnnou chromatografií. Přítomnost COS ve frakcích lze poté detekovat kolorimetricky, spojené frakce analyzovat pomocí HPLC s MS a/nebo ELS detekcí, a tak získat dobře charakterizované COS. Pomocí těchto standardů lze optimalizovat metodu HPLC s UV a ELS detekcí a použít ji jako nástroj rutinní analýzy COS. Po přípravě analytických standardů a po optimalizaci HPLC metody bude naším cílem stanovit COS v chitosanových doplňcích stravy, tzn. zjistit, zda nedochází ke klamavému označení těchto doplňků.

V Evropské Unii se jako krmivo pro hospodářská zvířata nejvíce používá sója. Sója a další plodiny byly geneticky modifikovány s cílem získat co nejlepší agronomické vlastnosti. Především se jedná o odolnost proti hmyzu a odolnost k herbicidům. Podle evropského nařízení musí být nové potraviny vyrobené z geneticky modifikovaných organismů (GMO) označeny. Kontrola takto označených potravin je založena na detekci dílčích sekvencí DNA pocházející z GMO. Nejpoužívanějším přístupem pro detekci a kvantifikaci GMO je kvantitativní PCR s fluorescenční detekcí v reálném čase (qPCR). Cílem mé práce je provést kvantitativní stanovení Roundup Ready sóji (RRS) pomocí metody qPCR, následně pak provést odhad nejistoty výsledku a totéž zopakovat i pro GM kukuřici. Pro kvantifikaci RRS metodou qPCR byla vytvořena kalibrační řada připravená čtyřkovým a dvojkovým ředěním referenčního materiálu s obsahem 5 % GMO. Referenční materiál s obsahem 1 % GMO byl izolován ve dvou paralelách a následně použit jako vzorek. Ze získaných výsledků měření se poté vypočítala relativní standardní nejistota (RSD) a z percentuálního zastoupení RRS ve vzorku rozšířená nejistota (U).