Studentská vědecká konference

Chindoliny jsou obsaženy ve výtažcích rostlin, dlouhodobě používaných v přírodním léčitelství. Zvýšené pozornosti se dostalo kryptolepinu, jednomu z chindolinových derivátů, po zjištění, že je schopen vázat se na G-kvadruplexy DNA a tím tyto sekundární struktury nukleových kyselin stabilizovat. Zvláště významná je stabilizace v promotorové oblasti protoonkogenu c-myc, která potlačuje jeho expresi, jež bývá zvýšená u většiny typů nádorů. Přírodní chindoliny však nejsou dostatečně selektivní k nádorovým buňkám, proto bylo započato hledání nových syntetických G-kvadruplexových ligandů na bázi chindolinového skeletu. Předmětem této práce jsou právě dva z těchto chindolinových derivátů. Pomocí konfokální mikroskopie bylo prokázáno, že se tyto látky lokalizují v buněčném jádře a byla stanovena koncentrace, která zabíjí 50 % populace buněk. Specifické ověření vazby na G-kvadruplexy bude provedeno pomocí reportérové eseje v rámci jiného výzkumu. Dále bylo pomocí predikčního softwaru předpovězeno, že tyto deriváty mohou ovlivňovat funkci P-glykoproteinu - efluxní transmembránové pumpy, sloužící jako obranný mechanismus organismu před xenobiotiky. Luminiscenční metodou bylo prokázáno, že oba deriváty mají vliv na aktivitu oné pumpy, a tedy mohou být schopné snižovat lékovou resistenci.

Stříbro má širokospektrální antimikrobiální účinky a celou řadu charakteristických fyzikálně-chemických vlastností. Díky tomu jsou nanočástice stříbra (AgNPs) jedny z nejrozšířeněji používaných nanočástic v širokém spektru výrobků a mají schopnost pronikat do všech přírodních ekosystémů. Například nesprávná likvidace, náhodné úniky, použití AgNPs jako "organického" hnojiva/pesticidu mohou být zdrojem kontaminace životního prostředí. Stříbro stejně jako těžké kovy se v životním prostředí akumuluje, a ačkoliv v nízkých koncentracích může být zdánlivě neškodné, se vzrůstajícím využitím tohoto kovu vzrůstá i jeho koncentrace v životním prostředí, která již může působit toxicky. Z tohoto důvodu jsou nezbytné studie zabývající se vlivem nanočástic na jednoduché i složité živé systémy za kontrolovaných i reálných podmínek. Záměrem této práce je zjistit, jakým způsobem a v jaké míře AgNPs ovlivňují životní prostředí. Studie je realizována za kontrolovaných podmínek v systému zemina-rostlina (Arabidopsis thaliana Col-0). Prostřednictvím biochemických testů, analýzy vlastností podporujících růst rostlin, profilováním mikrobiální komunity mikrobiologickými a genetickými metodami jsou sledovány potenciální změny půdního mikrobiomu způsobené přidáním vzrůstajícího množství AgNPs.  

  Plasmatická membrána slouží buňkám jako účinná bariéra oddělující je od vnějšího prostředí a zajišťující jejich stabilitu. Své specifické funkce plní skrz membránové proteiny, které jsou v ní zabudované. Mezi ně patří i flotiliny, jejichž úloha v metabolismu buňky byla předmětem studia především u savců, kde byla spojena se specializovanou formou endocytosy. U rostlin ještě není jejich role zcela objasněna. Pro odhalení interakčních parterů rostlinného flotilinu 1, které by mohly pomoci objasnit jeho funkci, byla využita imunoafinitní purifikace (IAP) s hmotnostně-spektrometrickou detekcí. Výchozím biologickým materiálem byly listy čtyřtýdenních rostlin Arabidopsis thaliana se zvýšenou produkcí fúzního proteinu flotilinu 1 a GFP (Flot1‑GFP). Úspěšně transformované rostliny byly selektovány pomocí fluorescenční mikroskopie a touto metodou byla též potvrzena lokalizace Flot1-GFP na plasmatické membráně. Pro izolaci PM frakce byla použita metoda diferenciální ultracentrifugace a separace membrán v dvoufázovém systému dextranu a polyethylenglykolu. Získané vzorky byly charakterizovány pomocí elektroforézy a imunoblotu s využitím protilátek proti GFP a podrobeny IAP a nabohacené proteiny byly detekovány pomocí LC-MS/MS.

Kyselina mléčná má u nádorových buněk nezanedbatelnou roli v různých ohledech. Hypoxické buňky ji produkují jako odpadní produkt anaerobní glykolýzy a ta se dále využívá jako zdroj energie či signalizační molekula. Naším cílem je zjistit, jaký vliv má kyselina mléčná na antioxidační schopnost nádorových buněk, které zkoumáme 3 různými metodami na buněčných linií PaTu a HeLa. Tyto buňky ovlivňujeme médiem s přídavkem kyseliny mléčné a médiem s nižším pH. První metodou je měření antioxidační kapacity pomocí dichloro-dihydro-fluorescein diacetátu. U této metody je znatelný pokles antioxidační kapacity buněk u média s přídavkem kyseliny (bez rozdílu, jestli to byla kyselina mléčná nebo HCl). Dále využíváme qPCR s primery genů, které kódují cytoprotektivní proteiny chránící buňku před oxidačním stresem, jako jsou HMOX-1, NQO1 a GLS. U tohoto experimentu vidíme, že přítomnost vyšší koncentrace kyseliny mléčné zvýší transkripci těchto genů. Třetí metoda je imunoblot, kterým se zjišťuje semikvantitativně množství transkripčního faktoru těchto genů, Nrf2. U buněk PaTu při šesti hodinové expozici experimentálních médií je množství Nrf2 vyšší u média s přídavkem dvojnásobné koncentrace kyseliny mléčné oproti buňkám Hela, kterým ke zvýšení množství Nrf2 stačí poloviční koncentrace.

Kyselina salicylová (SA) je, co by signální molekula, nesmírně důležitá pro rostliny při boji s jejich úhlavními nepřáteli. Mezi ně patří především napadení patogeny, ale účastní se i odpovědí na sucho, extrémní teploty či zasolení. SA je součástí imunitního systému rostlin, který když je kvůli nadbytku SA neustále aktivován má za následek retardaci růstu rostlin. V této práci jsme se rozhodli vytvořit unikátní kolekci mutantních rostlin Arabidopsis thaliana s ovlivněnou drahou SA a využít ji jako nástroj pro komplexní studium role SA především při studiu kompromisu mezi růstem a obranou rostlin a ve spojení s abiotickým stresem. Naše dosavadní sbírka čítá čtrnáct mutantů s pozměněnou SA drahou. Rostlinné genotypy nyní charakterizujeme v našich pěstebních podmínkách. Máme v plánu změřit obsah SA pomocí metody HPLC v různých vývojových stádiích a posoudit jejich fenotyp při růstu v zemině i in vitro a následně se zabývat vlivem světla na růst těchto mutantů. Tuto naši sbírku nadále plánujeme rozšiřovat. Máme za to, že může do budoucna přinést mnoho cenných informací o roli SA v reakcích na různé stresy spojené s vlivem na růst rostlin.

Mykotoxiny jsou sekundární metabolity mikroskopických vláknitých hub, jejichž výskyt je monitorován zejména z toxikologických důvodů. V České republice existují normy pro stanovení přípustného obsahu mykotoxinů v krmivech a potravinách. Avšak problematika jejich vzájemných interakcí a synergických efektů je nedostatečně prozkoumaná. V této práci byla sledována akutní toxicita 13 mykotoxinů na lidských buněčných liniích. Akutní toxicita byla prokázána u T-2, HT-2 a také u diacetoxyscirpenolu. Dále byl testován synergický efekt vybraných kombinací mykotoxinů, kde zvýšení akutní toxicity bylo detekováno zejména u kombinace T-2 a HT-2 toxinů. Naší hypotézou je možné zmírnění toxického působení mykotoxinů protektivním účinkem silymarinu. Tento komplex flavonoidů extrahovaný ze semen a plodů ostropestřce mariánského je mimo jiné součástí mnoha potravinových doplňků, které mohou vedle látek s pozitivním účinkem obsahovat také produkty plísní. Tato hypotéza již byla potvrzena sérií pilotních pokusů. Z našich výsledků je patrné, že účinek mykotoxinů může být negován přítomností antioxidantu. Jelikož se mykotoxiny v rostlinách mnohem častěji vyskytují ve směsi, je zřejmé, že kombinační efekt těchto směsí je nadále nutné studovat a případně legislativně zohlednit.

Nikotinamidfosforibosyltransferasa (Nampt) neboli visfatin je protein, který intracelulárně působí jako esenciální enzym. Avšak byl detekován také v extracelulárním prostředí, kde jeho funkce nebyla prozatím zcela odhalena. Kromě toho není odhalen ani mechanismus jeho sekrece. Zjistili jsme, že Nampt je aktivně sekretován buňkami imunitního systému. Dosavadní studie vyloučily možnost sekrece konvenční sekreční drahou a přiklánějí se spíše k některé z nekonvenčních sekrečních drah. Cílem naší práce bylo sledovat vliv inhibitorů sekrečních drah na sekreci Nampt.   Sekrece Nampt makrofágy U937 byla stanovována v kultivačních médiích metodou imunoblotu. Inhibitory konvenční sekreční dráhy, Brefeldin A a Monensin, způsobily snížení sekrece Nampt. Dále byl testován vliv L-asparaginu, inhibitoru nekonvenční sekreční dráhy na principu autofagie, který také snížil sekreci Nampt. Fluorescenční mikroskopií byla sledovaná intracelulární lokalizace a transport GFP‑Nampt v makrofázích U937. Neovlivněné buňky měly GFP-Nampt lokalizován v blízkosti cytoplasmatické membrány, kdežto Brefeldin A zastavil transport GFP-Nampt k membráně.  Naše výsledky popírají dosavadní studie, které zcela vylučují sekreci Nampt konvenční sekreční dráhou.