Studentská vědecká konference

Podle šetření Evropského úřadu pro bezpečnost potravin je Campylobacter jejuni dlouhodobě nejčastějším původcem gastrointestinálních onemocnění v zemích EU. Nejrizikovější potravinou je nedostatečně tepelně upravené drůbeží maso, přičemž infekční dávka je velice nízká, pohybuje se v řádech stovek bakterií. Metody pro stanovení počtu C. jejuni v potravinách by tedy měly být přesné a mít nízký detekční limit. V současnosti se používá Evropská norma ISO/TS 10272-2:2006, dle které lze zjistit, zda vzorek obsahuje více než 1 x 10³ KTJ. Toto stanovení je vzhledem k infekční dávce onemocnění nedostatečné. Cílem práce je navržení spolehlivé a přesné metody kvantifikace C. jejuni založené na semikvantitativní real-time PCR, kdy bude počet bakterií C. jejuni stanoven přepočítáním podle množství bakterie E. coli, která se na kuřatech často vyskytuje a je jednoduše kultivovatelná. Doposud byla izolována DNA 28 kmenů, včetně 3 kmenů C. jejuni a 2 kmenů E. coli. Vybrané kmeny představují především doprovodnou mikroflóru C. jejuni a slouží k otestování specifity primerů pro real-time PCR s C. jejuni a E. coli. V současné době provádím běžnou PCR a vyhodnocuji specifitu daných primerů. Dále také provádím oplachy vzorků kuřat z tržní sítě pro vyhodnocení kolonizace vzorků bakterií E. coli.

Norovirus je významný patogen vyvolávající gastroenteritidy přenášený potravinami a vodou. K detekci norovirů se používají molekulárně genetické metody. V laboratořích zabývajících se touto problematikou je používaný postup popsaný v normě ČSN EN ISO 15216. Jedná se o horizontální metodu pro stanovení viru hepatitidy A a noroviru pomocí reverzní transkripce a polymerázové řetězové reakce v reálném čase (RT-qPCR). Norma popisuje kroky detekce zahrnující izolaci RNA, RT a kvantifikaci pomocí qPCR. Pro zajištění správnosti výsledků je do procesu zahrnuta sada kontrol včetně kontrolního viru. Na základě vlastností, které by měl kontrolní virus mít, byly ve Výzkumném ústavu veterinárního lékařství v Brně navrženy fágové částice. Jedná se o MS2 bakteriofága, který nese umělou RNA obsahující specifickou kontrolní sekvenci získanou z mitochondriální DNA vakovlka tasmánského a ptáka moa.  Cílem mé práce je ověřit použitelnost této kontroly při procesu detekce norovirů. Na fágových částicích byly nejdříve testovány 3 metody izolace RNA, normativní metoda založená na principu magnetických částic, fenol-chloroformová extrakce a izolace pomocí centrifugačních RNA vazebných kolonek, což je první krok horizontální normativní metody.  

Endofyté jsou mikroorganismy, které žijí přechodně nebo trvale v pletivech rostlin, podporují jejich růst a chrání je před stresem. Výsledky jsou součástí tříletého projektu, ve kterém je sledován vztah endofytní mikroflóry a metabolomu Vitis vinifera L.. V prvním roce byla práce zaměřena na izolaci kultivovatelných endofytních bakterií a jejich identifikaci MS MALDI-TOF. Byl zkoumán vliv několika faktorů na mikrobiální diverzitu. Prvním faktorem byla odrůda, kdy pro tuto studii byly vybrány čtyři odrůdy (Ryzlink rýnský, Rulandské modré, Rulandské šedé a Müller Thurgau). Dále byl sledován vliv vegetačního období, způsobu zemědělských praktik a části rostliny, ze které byla izolace provedena. Vzorky byly odebírány na hnojené vinici Grébovka v Praze a na biovinicích v Kutné Hoře. V následujících letech bude práce rozšířena o biochemické, analytické a molekulárně biologické testy, které budou zaměřeny na charakterizaci endofytní mikroflóry podle jejich PGP (plant growth promotion) vlastností. Ze získaných dat je patrné, že sledované faktory mají vliv na mikrobiální diverzitu. Bylo zjištěno, že na jaře je zastoupení endofytů v listech větší než během jiných vegetačních období, kdy jich více nalezneme v letorostech. Práce vznikla za finanční podpory projektu GA 18-26463S.  

Většinu mikroorganismů z okolního prostředí nelze kultivovat v laboratorních podmínkách. Jedním z důvodů je VBNC (viable but non-culturable) stav buněk, kdy buňky do jisté míry metabolizují, ale nejsou schopny se dělit. Jednou z možností, jak mikroorganismy ze stavu VBNC resuscitovat, je použití proteinů zvaných Rpf (Resuscitation promoting factors). Cílem této diplomové práce je ověřit a specifikovat vliv SRpf (Supernatant obsahující Rpf) z kultury mikroorganismu Micrococcus luteus na diverzitu mikroorganismů izolovaných z půdy. Předpokládá se, že extrakce mikroorganismů z půdy s použitím SRpf povede k vyššímu počtu živých (dělení schopných) vyextrahovaných buněk. To je ověřováno bioaugmentačními experimenty, při nichž jsou do sterilní zeminy individuálně inokulovány vybrané bakteriální kmeny, které jsou následně extrahovány a životaschopné buňky jsou kvantifikovány. Druhým předpokladem je, že SRpf zvyšuje druhovou diverzitu extrahovaných půdních mikroorganismů. K ověření tohoto předpokladu se mikroorganizmy extrahují z reálných vzorků zeminy a následně jsou identifikovány pomocí MALDI-TOF MS a sekvenace genů pro 16SrRNA. Ve všech experimentech se srovnává extrakce s aktivním SRpf, inaktivovaným SRpf a zcela bez SRpf.  

V súčasnosti sa stretávame z mnohými falšovanými potravinami a obchodníci stále rozvíjajú nové spôsoby podvodov v potravinárskom priemysle za zámerom zvýšenia finančných ziskov. Dopyt a konzumácia rýb v poslednej dobe stále stúpa, a tým sa stáva rybie mäso jedným z najčastejšie falšovaných potravín. S nárastom falšovania rýb je potreba stále vyvíjať nové a spoľahlivé metódy na ich odhaľovanie. K detekcii rybieho mäsa sa do popredia dostávajú molekulárno-biologické metódy, predovšetkým polymerázová reťazová reakcia (PCR). Cieľom práce je navrhnúť a overiť protokol PCR rýb z čeľade makrelovitých, založených na analýze jadrovej DNA. Prvotným krokom experimentu je izolácia DNA z vybraných druhov rýb pomocou upravenej metódy založenej na použití cetyltrimetylamónium bromidu (CTAB). Takto bola DNA izolovaná zo vzoriek svaloviny rýb, konkrétne z makrely obecnej, pelamidy obecnej a tuniaka. Vzorky DNA boli analyzované PCR metódou založenej na amplifikácii sekvencie parvalbumínového génu. Po sekvenácii PCR produktov bude hlavnou úlohou zo známej sekvencie tohto genómového markera navrhnúť a overiť špecifické primery k ich spoľahlivej druhovej identifikácii. Súčasťou práce tiež bude upraviť používaný protokol izotermickej amplifikačnej metódy (LAMP) pre identifikáciu makrely obecnej.

Bakterie rodu Campylobacter patří mezi významné potravinové patogeny. Mimo hostitele musí tyto bakterie překonat řadu stresových faktorů. Nejčastějším protektivním mechanismem, kterým se mohou buňky se stresem vyrovnat, je tvorba biofilmu. Uvnitř biofilmu jsou buňky schopny regulovat své „společenské chování“ pomocí koordinované změny exprese genů, které je dosaženo i díky systému mezibuněčné komunikace známé jako quorum sensing. Funkčnost tohoto mechanismu je podmíněna přítomností luxS genu, který je zodpovědný za produkci signální molekuly autoinduktor 2 (AI-2). V této práci byla vybrána skupina čtyř izolátů bakterie C. jejuni a dva izoláty bakterie C. coli různého původu.  U izolátů byla pomocí specifických primerů nejprve detekována přítomnost luxS genu. Mikroaerobní kultivací izolátů v tekutém médiu Mueller-Hinton při 42 °C a následnou centrifugací a filtrací byl získán supernatant bez obsahu buněk, u nějž byla zjišťována přítomnost molekuly AI-2 pomocí měření bioluminiscence s využitím referenčního kmene Vibrio harveyi. Gen luxS byl přítomen ve všech izolátech kromě C. jejuni 18515, v jehož supernatantu však bylo paradoxně detekováno vyšší množství AI-2 než v potravinovém izolátu C. jejuni 3ř či klinických izolátech C. jejuni 81-176 a C. jejuni 2881.  

Radioaktivní izotop uhlíku (¹⁴C), vznikající ve vyšších atmosférických vrstvách vlivem kosmického záření, je metabolicky inkorporován do všech živých organismů. Od okamžiku přerušení příjmu ¹⁴C z okolí klesá jeho aktivita v organismu rychlostí, která je úměrná poločasu přeměny 5730 ± 40 let. Pro forenzní účely se používá radiouhlíkové datování pomocí bombového píku, kterým lze určit dobu úmrtí organismu či nárůst konkrétní tkáně u recentních vzorků. Pro určení doby úmrtí byly použity vzorky lidských kostí, ze kterých byl izolován kolagen a tuk jako datovatelné chemické formy uhlíku. Pro stanovení aktivity ¹⁴C byla použita urychlovačová hmotnostní spektrometrie (Accelerator Mass Spectrometry – AMS), která přímo stanovuje počet jednotlivých atomů ¹⁴C ve vzorku, namísto měření jednotlivých radioaktivních přeměn. Aktivita ¹⁴C v měřených vzorcích, která je vztažena k radiouhlíkovému standardu – kyselině šťavelové, byla vyjádřena pomocí Fraction Modern (F¹⁴C = A_SN/A_ON). Rozdílné výsledky aktivity ¹⁴C u vzorků kostního kolagenu a tuku odhalily různou dobu zdržení datovatelných forem uhlíku v lidských tkáních.