Studentská vědecká konference

Mason-Pfizerův opičí virus (M-PMV) je retrovirus, u kterého dochází na rozdíl od viru lidské imunodeficience (HIV) k sestavení nezralé virové částice již v periplazmatické oblasti hostitelské buňky. M-PMV ve svém genomu též na rozdíl od HIV kóduje tzv. G-patch doménu (GPD), která je u prekurzorových polyproteinů Gag-Pro a Gag-Pro-Pol lokalizována mezi sekvencí proteasy a reverzní transkriptasy. Úloha této domény zatím odhalena nebyla, avšak současné poznatky ukazují na to, že by mohla hrát roli při transkripci či sestřihu, popřípadě transportu virové mRNA. Cílem práce je identifikovat proteiny hostitelské buňky, které s GPD interagují a které jsou současně s touto doménou inkorporovány do virionů. K tomuto účelu byl využit přístup kvantitativní proteomické analýzy celých virionů. Po izolaci GPD deficientních (ΔGPD) virionů M-PMV byla provedena jejich charakterizace a následně proteomická analýza pomocí LC-MS/MS. Získané hladiny hostitelských proteinů detekovaných v ΔGPD virionech budou porovnány s hladinami hostitelských proteinů detekovaných v částicích M-PMV divokého typu získaných v předchozí studii. Proteiny, které nebudou detekovány v ΔGPD virionech M-PMV a přitom budou detekovaných v částicích M-PMV divokého viru budou navrženy jako potenciální interakční partneři GPD.

Myelodysplastický syndrom (MDS) je skupina heterogenních onemocnění hematopoetických kmenových buněk vyznačující se cytopenií v periferní krvi a vysokým rizikem progrese do akutní myeloidní leukémie (AML). V rámci této práce byly studovány hladiny dlouhých nekódujících RNA (lncRNA) u myelodysplastického syndromu. Pro analýzu množství vybraných transkriptů lncRNA v CD34+ progenitorových buňkách kostní dřeně jsme zavedli metodu reverzní transkripce s následnou real-time PCR detekcí (RT-qPCR). Touto metodou jsme detekovali relativní množství konkrétních lncRNA (EGOT, EPB41L4, FAM225A, HOTAIRM, CHRM3A82, IGF2, LEF1-AS1, LEF1, MEG3, PVT1, TCL6, WT1-AS1 a WT1) u 81 pacientů s různými subtypy MDS, 14 pacientů s akutní myeloidní leukémií s myelodysplastickými rysy (AML-MRC) a 13 zdravých dárců.  Následná statistická analýza identifikovala lncRNA s rozdílnou hladinou mezi jednotlivými kategoriemi pacientů, což poukazuje na jejich možný význam v patogenezi onemocnění. U některých sledovaných lncRNA (H19, WT1-AS, LEF1-AS, MEG3 a TCL6) jsme dokonce prokázali, že jejich hladina se významně liší mezi pacienty s dobrou a špatnou prognózou. Tyto lncRNA by tak mohly sloužit jako potenciální molekulární markery MDS.

Přirozená schopnost hub akumulovat ve svých plodnicích značné množství různých těžkých kovů je známa již několik desetiletí. Zatímco u většiny makroskopických hub se koncentrace Cd pohybují v jednotkách či maximálně desítkách mg Cd kg^-1 suché váhy plodnice, u saprotrofní houby Cystoderma carcharias byly naměřeny koncentrace až 600 mg Cd kg^-1 suché váhy. Cílem této práce bylo charakterizovat genetické aspekty, díky kterým má tato houba schopnost akumulovat ve svých plodnicích vysoké množství Cd. Pro tento účel byla z mRNA C. carcharias zkonstruována cDNA expresní knihovna, která byla následně exprimována v Cd‑sensitivním kmenu kvasinek Saccharomyces cerevisiae ycf1Δ. Tato analýza umožnila identifikaci dvou cDNA sekvencí kódující 2 peptidy o délce 33 aminokyselin. Bioinformatická analýza peptidových sekvencí ukázala, že tyto peptidy (označené CcMT1 a CcMT2) spolu sdílejí téměř 73% podobnost a obsahují motivy Cys-AK-Cys, typické pro sekvence metalothioneinů. Následné funkční studie provedené v mutantním kmenu S. cerevisiae ycf1Δ potvrdily schopnost obou peptidů CcMT1 a CcMT2 zvyšovat toleranci těchto kvasinek k Cd. Tyto výsledky naznačují, že by CcMT1 a CcMT2 v plodnicích C. carcharias mohly hrát významnou roli pro schopnost tolerovat tak vysoké koncentrace Cd.

Transmembránový protein STING (TMEM173) je součástí signalisační dráhy cyklo GMP-AMP synthasa – cyklický dinukleotid – STING (cGAS-CDN-STING), která vede k aktivaci vrozené imunitní buněčné odpovědi. Přirozeným ligandem STING proteinu je (2´,3´)-cGAMP (cyklo [G(2’,5’)pA(3’,5’)p]), synthetisovaný enzymem cGAS po navázání volné dsDNA v cytosolu. Prvním cílem práce bylo připravit deset rekombinantních variant lidského proteinu STING se záměnou jedné aminokyseliny ve vazebném místě a metodou diferenční skenovací fluorimetrie (DSF) ověřit vliv mutace na interakci STING-CDN. Výsledky byly použity pro simulace vazebného místa in silico. Některé stabilisující kombinace STING-CDN byly vybrány pro určení struktury rentgenovou krystalografií. Druhým cílem práce bylo připravit rekombinantní myší a sviští protein STING a otestovat metodou DSF afinitu obou proteinů k panelu standardních CDN a k „lead compounds“. Třetím cílem byla příprava modelové HEK 293T buněčné linie dvojitě stabilně transfekované sviští nebo myší formou genu pro protein STING a reportérovým genem pod promotor ISRE, umožňující sledování míry aktivace cGAS-CDN-STING signalisační dráhy. Model byl ověřen standardními CDN a použit ke stanovení střední efektivní koncentrace (EC50) připravených „lead compounds“.  

Diagnostika norovírusov z pohľadu molekulárnej genetiky   Norovírusy sú neobalené jednovláknové RNA vírusy patriace do čeľade Caliciviridae. Sú hlavnou príčinou akútnej gastroenteritídy pochádzajúcej z vody a potravy. Ako hlavné detekčné metódy na ich stanovenie sa používajú imunochemické metódy, elektrónová mikroskopia a molekulárne – genetické metódy, založené na polymerázovej reťazovej reakcii s fluorescenčnou detekciou v reálnom čase (qPCR). Cieľom tejto práce je osvojenie si postupu horizontálneho stanovenia norovírusov podľa normy ČSN P CEN ISO/TS 15216-1. Toto stanovenie je založené metóde qPCR, kedy je umožnené sledovať narastajúce množstvo amplifikovanej DNA v reálnom čase. Z dôvodu komplexnosti metódy je do celého procesu zahrnutá rada kontrol. Pre účely metódy bola preto navrhnutá pozitívna kontrola (PC). Jedná sa o jednovláknovú DNA o dĺžke 150 báz. Pre vyhodnotenie výsledkov po prebehnutí PCR bola na overenie jej funkčnosti zostrojená kalibračná priamka a tiež bola využitá horizontálna elektroforéza v agarózovom géli. Súčasťou ďalšej práce bude navrhnutie kontrolného plazmidu obsahujúceho sekvencie časti genómu norovírusov vhodného na dôkaz vírusových častíc prostredníctvom reverznej transkripcie a qPCR.  

Retroviry řadíme mezi obalené RNA viry, způsobující infekce hostitele, spojené s výskytem mnoha závažných onemocnění. Vývoj antiretrovirotik, fungujících na principu inhibice různých kroků retrovirového životního cyklu, je tedy aktuálním tématem. Během vstupu zralé retrovirové částice do cytoplasmy hostitelské buňky je obnažena virová kapsida, tvořená strukturním kapsidovým proteinem a obsahující genomovou RNA a další enzymy. Jedním ze způsobů inhibice životního cyklu retrovirů je destabilizace kapsidy, a tedy její předčasný rozpad, či naopak její stabilizace, a tedy zabránění jejího rozpadu. Cílem práce je připravit kapsidové proteiny HIV a M-PMV v dostatečném množství a čistotě a v různých podmínkách sledovat jejich schopnost tvořit částice simulující kapsidy in vitro. Dalším krokem je vzájemně porovnat stabilitu vytvořených kapsid a zjistit vliv přítomnosti inhibitoru PF74 na jejich tvorbu a stabilitu. Kapsidové proteiny byly produkovány v bakteriálním expresním systému a purifikovány afinitní chromatografií. Transmisní elektronovou mikroskopií bylo pozorováno, že pro tvorbu kapsid HIV je potřeba vysoká iontová síla, zatímco pro tvorbu kapsid M-PMV nikoliv. Ultracentrifugací kapsid v sacharosovém gradientu bylo zjištěno, že jsou velmi nestabilní.  

HIV-1 je RNA virus z čeledi Retroviridae, který se rozšířil ze střední Afriky a způsobuje AIDS (Acquired Immunodeficiency Syndrome) – syndrom získaného selhání imunity. Tato nemoc byla od roku 1981 diagnostikována u desítek miliónů lidí. Jde tedy o široce rozšířený problém v dnešním moderním světě. Většina léčiv, které se v dnešní době využívají v antiretrovirové terapii pouze zpomalují průběh onemocnění. Je tedy stále důležité hledat nové cíle pro efektivní léčbu. Kapsidový protein HIV-1 patří k potenciálním cílům, protože infekčnost HIV závisí na jeho správném sbalení kapsidy viru nebo rozbalení v cílových buňkách. V této práci jsme se zaměřili na zkoumání interakce potencionálních inhibitorů těchto procesů s N-terminální doménou kapsidového proteinu pomocí NMR spektroskopie. Jako první byl vybrán inhibitor PF74 (PF-3450074) u kterého je známo, že inhibuje časnou fázi HIV replikačního cyklu. Z tohoto měření jsme byli schopni identifikovat aminokyseliny, které tvoří vazebné místo v N-terminální části kapsidového proteinu. Dále jsme testovali několik dalších molekul, u kterých bylo naším cílem zjistit, jestli také interagují s kapsidovým proteinem.