1
|
Bc.
Kristýna
Adámková
|
M2
|
doc. Ing. Petra Lipovová, Ph.D.; Mgr. Tomáš Kovaľ, Ph.D.
|
Studium interakcí na zinku závislé nukleasy s RNA pomocí rentgenové krystalografie
|
detail
Studium interakcí na zinku závislé nukleasy s RNA pomocí rentgenové krystalografie
Na zinku závislá nukleasa náleží do rodiny S1-P1 nukleas, které jsou studovány především pro své biotechnologické využití a případné aplikace v medicíně. Jedná se o jednořetězcově specifickou nukleasu, jejíž produkty a zároveň kompetitivní inhibitory jsou 5‘-mononukleotidy, mononukleosidy i ionty fosfátu. Byly objasněny struktury komplexů této nukleasy s produkty štěpení DNA. Díky těmto výsledkům byla vysvětlena vysoká schopnost přizpůsobení aktivního místa přítomnému ligandu, a tím i nespecifita k bázím.
Cílem této práce je studium interakce této nukleasy s RNA na základě struktur komplexů nukleasy s produkty štěpení RNA a následné porovnání výsledků s daty naměřenými pro vazbu ssDNA. Z měření rentgenové difrakce krystalů těchto komplexů byla získána data s vysokým difrakčním limitem. Tato data byla zpracována. Dvě struktury komplexů nukleasy s ligandy uridinem a cytidin-5‘-monofosfátem byly vyřešeny a upřesněny. Z dosavadních výsledků je jasné, že způsob interakce s těmito ligandy je velmi podobný jako s produkty štěpení ssDNA.
|
2
|
Bc.
Zuzana
Amlerová
|
M2
|
RNDr. Michael Mareš, CSc.; Ing. Zdeněk Knejzlík, Ph.D.
|
Příprava rekombinantního lidského katepsinu V a analýza jeho inhibice
|
detail
Příprava rekombinantního lidského katepsinu V a analýza jeho inhibice
Katepsin V je cysteinová proteasa s vysokou elastinolytickou aktivitou, která je specificky exprimována v několika typech nádorové tkáně. Představuje potenciální diagnostický marker a cílovou molekulu pro vývoj protinádorových léčiv. Tato práce je zaměřena na přípravu rekombinantního katepsinu V v dostatečném množství a čistotě. K produkci byl využit expresní systém v kvasince Pichia pastoris, kde byl katepsin V produkován jednak ve formě aktivního enzymu a jednak jako neaktivní mutant. Rekombinantní protein byl purifikován pomocí gelové permeační a ionexové chromatografie. Připravená aktivní forma enzymu je používána při analýze nových inhibitorů na bázi vinylsulfonů v kinetickém aktivitním testu s fluorogenním substrátem. Mutantní forma katepsinu V bude využita pro strukturní krystalografickou analýzu.
|
3
|
Bc.
Jiří
Bejček
|
M2
|
Ing. Silvie Rimpelová, Ph.D.
|
Nové konjugáty digitoxinu s BODIPY jako inhibitory Na+/K+ ATPasy: od molekulového dockování po tkáňové kultury
|
detail
Nové konjugáty digitoxinu s BODIPY jako inhibitory Na+/K+ ATPasy: od molekulového dockování po tkáňové kultury
Srdeční glykosidy zahrnují pestrou skupinu látek živočišného i rostlinného původu. V medicíně se díky svému pozitivnímu ionotropnímu účinku využívají při léčbě srdečního selhání a srdečních arytmií. Tento účinek je zprostředkován pomocí inhibice sodno-draselné ATPasy (NKA) – membránového proteinu – jehož inhibice vede mimo jiné také k apoptóze buňky. Digitoxin a jeho deriváty byly díky zmíněnému faktu v této práci studovány pro svůj potenciál stát se v budoucnu možnými teranostatiky, tedy látkami snoubícími v sobě jak terapeutické, tak diagnostické vlastnosti, v léčbě rakoviny.
Testováno bylo celkem 11 látek: digitoxin, jeho fluorescenční i nefluorescenční deriváty a samotné fluorofory. K tomuto účelu byly vybrány metody molekulového dockování, testy cytotoxicity na tkáňových liniích A549, HEK 293T, MRC-5 a L929 pomocí WST-1 a fluorescenční mikroskopie.
Bylo zjištěno, že digitoxin a jeho deriváty vykazují výrazné cytotoxické účinky na buňky linií A549, HEK 293T a MRC-5. Jako další budou provedeny kolokalizační studie s markery buněčných organel a kolokalizační studie s fluorescenční NKA.
|
4
|
Bc.
Klára
Beňatinská
|
M2
|
Ing. Zita Purkrtová, Ph.D.
|
Příprava hydrofilních domén oleosinu 2
|
detail
Příprava hydrofilních domén oleosinu 2
Lipidová tělíska jsou samostatné organely. V rostlinách se nejčastěji vyskytují v endospermu semen a jsou zapojeny do mnoha fyziologických procesů. Slouží například jako úložiště energie ve formě triacylglycerolů. Povrch lipidových tělísek je stabilizován proteiny, mezi které patří mimo jiné také strukturní proteiny nazývané oleosiny. Oleosiny se skládají z dlouhé vnitřní hydrofobní domény (až 70 AMK zbytků) a ze dvou kratších hydrofilních domén N-koncové a C-koncové (cca 30–70 AMK zbytků). Důležité je, že délka hydrofobních domén se mezi oleosiny neliší, zatímco délka hydrofilních domén ano. Ve své práci se zabývám konkrétně oleosinem 2 (At5g40420), který je v semenech rostlin nejčastěji zastoupený a má nejdelší hydrofilní domény (56 a 71 AMK zbytků). Cílem mé práce je připravit hydrofilní domény nejprve jako samostatné peptidy a poté také jako fúzní peptidy spojené pomocí linkeru. Takto připravené peptidy budou použity ke studiu vlastností a krystalografii. V současné době probíhá příprava expresního plasmidu pET16b nesoucího úsek genu kódujícího C-koncovou doménu oleosinu 2.
|
5
|
Bc.
Kristina
Brhlová
|
M2
|
Ing. Barbora Holubová, Ph.D.
|
Vývoj imunochemických metod pro detekci zástupců kathinonů a aminoindanů
|
detail
Vývoj imunochemických metod pro detekci zástupců kathinonů a aminoindanů
Člověk je schopen pro své tělesné a materiální potřeby překračovat hranice legislativy i zdravého rozumu. A to i přes riziko ztráty profesních a osobních vztahů nebo trvalého poškození zdraví. Jiné to není v případě užívání nových syntetických drog, které jsou vyráběny jako analoga již zakázaných drog. Nově a zpravidla domácky vyráběné substance nejsou zcela prozkoumány. Často u nich nejsou zjištěny krátkodobé ani dlouhodobé nežádoucí účinky. Proto představují mnohem větší riziko, o kterém uživatel nemusí mít tušení. Přesto jsou atraktivní alternativou díky své snadné dostupnosti, nižší ceně a dočasné bezúhonnosti. Studium struktury, metabolismu a detekce těchto látek je tedy zásadní informací pro legislativní orgány, které mají za cíl bezpečnost a zdraví celé společnosti.
Příkladem alarmující situace drogového trhu je bufedron a 5-iodo-2-aminoindan. Cílem této práce je vyvinout detekční imunochemické metody, které budou rychlé, levné a uživatelsky přístupné. Pro vývoj detekční metody ELISA byly vybrány vhodné imobilizační konjugáty, protilátky, pufry a další potřebné podmínky. Dále byla testována křížová reaktivita. Metoda byla sestavena pro 5-iodo-2-aminoindan. Ze sestavené kalibrační křivky byl určen detekční limit 93 ± 10 pg.ml-1 a další parametry metody.
|
6
|
Katerina
Brodsky
|
M2
|
Dr.sc. Michael Kotík, Ph.D.
|
Heterologní exprese a charakterizace fungální rutinosidasy
|
detail
Heterologní exprese a charakterizace fungální rutinosidasy
Rutinosidasa (α-L-rhamnosyl-β-D-glykosidasa; EC 3.2.1.168) je enzym ze skupiny diglykosidas, který odštěpuje disacharid rutinosu z příslušného rutinosidu. Rutinosidasy se vyskytují v bakteriích, archebakteriích a plísních. Některé z nich ukazují navíc i transglykosylační aktivitu, což je vlastnost nezbytná k syntéze nových rutinosidů. V rámci diplomové práce byla provedena exprese jedné fungální rutinosidasy (Mucor circinelloides) v expresním systému Komagataella pastoris. Gen kodující rutinosidasu byl vložen do expresního vektoru pPICZαA pro sekreci rekombinantního enzymu do kultivačního média; následovala transformace hostitelských buněk vzniklým plasmidem. Po integraci cizorodé DNA byl proveden screening aktivních transformantů fluorogenním substrátem 4-methylumbelliferyl-rutinosidem pomocí nativní elektroforézy. Aktivní klony byly kultivovány ve větším měřítku. Biomasa byla centrifugována a rekombinantní protein byl izolován afinitní chromatografií na základě C-terminální histidinové kotvy enzymu. Purifikovaný enzym byl vysrážen síranem amonným.
V současné době probíhá charakterizace rekombinantní rutinosidasy: stanovení teplotního optima, pH optima, substrátového spektra, optimálních podmínek pro transglykosylační aktivitu atd.
|
7
|
Bc.
Ondřej
Bulvas
|
M2
|
Ing. Zdeněk Knejzlík, Ph.D.
|
Význam proteinu Rel ve stringentní odpovědí u mykobakterií
|
detail
Význam proteinu Rel ve stringentní odpovědí u mykobakterií
Mykobakterie jsou rod grampozitivních bakterií zahrnující několik významných lidských patogenů. Nejvýznamnějším z nich je bezesporu původce tuberkulózy – Mycobacterium tuberculosis (MTB). Touto bakterií je v současnosti nakažena až třetina veškeré světové populace a s více než 1,5 miliony úmrtí ročně je na první příčce v počtu úmrtí na infekční choroby. Jedním z problémů v boji s MTB je schopnost tvořit vysoce perzistentní buňky. Za tento jev může z velké části tzv. stringentní odpověď řízená pomocí signální molekuly (alarmonu) (p)ppGpp. Centrálním regulátorem její hladiny je protein Rel, který by díky tomu mohl být zajímavým cílem nových chemoterapeutik. Pro studium proteinu Rel byl použit modelový organismus nepatogenní Mycobacterium smegmatis (MSM). Byl připraven kmen s úplnou delecí Rel a následně sledován její fenotypový projev na buňkách za různých růstových a stresových podmínek. Dalším z přístupů je hledání nových potenciálních interakčních partnerů proteinu Rel. Pro tento účel bude vytvořena DNA knihovna MSM, kterou lze poté využít ke studiu interakcí pomocí bakteriálního dvouhybridního systému. Zavedení a ověření funkčnost výše zmíněných metod by mohlo v budoucnu pomoci pochopit fascinující a stále nedostatečně popsaný systém stringentní odpovědi u mykobakterií.
|
8
|
Bc.
Eva
Fabínyová
|
M2
|
Ing. Sabina Purkrtová, Ph.D.
|
Využití Staphylococcus spp. pro forenzní identifikaci osob
|
detail
Využití Staphylococcus spp. pro forenzní identifikaci osob
Zloženie ľudskej kožnej mikroflóry je veľmi rozmanité a u každého jedinca špecifické. Dominantné zastúpenie tvoria baktérie rodu Staphylococcus, ktorých analýza by mohla nájsť využitie vo forenznej oblasti. Predpokladom pre túto analýzu je zavedenie spoľahlivých a rýchlych metód identifikácie a typizácie vybraných najčastejšie sa vyskytujúcich Staphylococcus spp. (S. aureus, S. cohni, S. epidermidis, S. haemolyticus, S. hominis, S. saprophyticus, S. warneri) využitím metód MALDI-TOF MS, RAPD-PCR, PFGE aj. a získané protokoly ďalej aplikovať na humánne izoláty týchto druhov Staphylococcus. V práci sme sa zamerali na identifikáciu a typizáciu druhu S. hominis metódou MALDI-TOF MS, s využitím zbierkových kmeňov a humánnych izolátov, ktoré boli taktiež identifikované pomocou súpravy STAPHYtest 24. Získané proteínové spektra zbierkových kmeňov boli využitím rôznych zhlukových analýz a programu ClinPro Tools (Bruker Daltonics) použité k vytvoreniu klasifikačných modelov, ktoré sme ďalej aplikovali k odlíšeniu S. hominis od ostatných Staphylococcus spp., či k odlíšeniu jednotlivých kmeňov S. hominis.
|
9
|
Bc.
Lucia
Fehérová
|
M2
|
Ing. Petr Svoboda
|
Príprava bunkovej línie produkujúcej visfatin s mutáciou H247A pre overenie vplyvu fosforylácie na jeho enzýmovú aktivitu
|
detail
Príprava bunkovej línie produkujúcej visfatin s mutáciou H247A pre overenie vplyvu fosforylácie na jeho enzýmovú aktivitu
Visfatin je popisovaný ako enzým zúčastňujúci sa syntézy NAD z nikotínamidu, kde katalyzuje prenos fosforibosylovej skupiny z 5-fosforibosyl-1-pyrofosfátu na nikotínamid za vzniku nikotínamidmononukleotidu a pyrofosfátu. Presný mechanizmus tejto reakcie ale nebol dosiaľ objasnený. Predpokladá sa, že pre priebeh enzýmovej katalýzy visfatinu je nevyhnutná autofosforylácia histidínu na 247. pozícii. Našim cieľom bolo tento predpoklad overiť.
Boli pripravené bunky HepG2 s produkciou visfatinu v prirodzenej forme (WT) a visfatinu s bodovou mutáciou H247A. Každá z foriem bola pripravená s pripojenou polyhistidínovou kotvou i bez nej. Nasledovalo meranie enzýmovej aktivity visfatinu v bunkovom lyzáte pomocou fluorescenčnej detekcie vznikajúceho NAD ako konečného produktu celej biosyntetickej dráhy z nikotínamidu. V porovnaní s kontrolou vykazoval visfatin-WT-HisTag aj visfatin-WT bez pripojenej histídinovej kotvy rovnako zvýšenú enzýmovú aktivitu, čím bol vylúčený vplyv histidínovej kotvy. Ich hodnoty enzymových aktivít sa však tiež zhodovali s aktivitami visfatinu-H247A a visfatinu-H247A-HisTag. Tým sa ukázalo, že visfatin s bodovou mutáciou H247A má zachovanú svoju enzýmovú aktivitu. Tieto výsledky naznačujú, že autofosforylácia nie je esenciálna pre enzýmovú katalýzu visfatinu.
|
10
|
Bc.
Zdeněk
Gajdík
|
M2
|
doc. Dr. Ing. Zuzana Novotná
|
Úloha isoforem fosfolipasy D v halotropismu Arabidopsis thaliana
|
detail
Úloha isoforem fosfolipasy D v halotropismu Arabidopsis thaliana
Rostliny musí během celého životního cyklu čelit nejrůznějším změnám prostředí (změny světla, teploty, množství vody, zasolení, napadení patogenem atd.). Sůl jako abiotický stresor negativně ovlivňuje růst rostlin a tím i jejich produktivitu.
Byla popsána řada mechanismů, kterými se rostlina brání zasolení. V této práci se zabýváme halotropismem, což je zahýbání kořene z oblasti o vyšší koncentraci soli do oblasti s nižší koncentrací. Současné modely naznačují, že sůl indukuje produkci jedné ze signálních molekul, kterou je kyselina fosfatidová (PA). Ta vzniká hydrolýzou membránových fosfolipidů, na které se podílí fosfolipasa D (EC 3.1.4.4, PLD). U modelové rostliny Arabidopsis thaliana bylo popsáno dvanáct isoforem PLD lišících se primární strukturou (PX-PH PLD a C2-PLD) i biochemickými vlastnostmi. Konkrétní isoformy C2-PLD ani mechanismus, jakým by se tyto isoformy mohly účastnit halotropismu nejsou dosud známy.
Cílem práce bylo najít nejvhodnější experimentální podmínky pro studium halotropismu kořene rostlin Arabidopsis thaliana divokého typu a homozygotních mutantních linií pldα, pldδ a pldζ. Nejvhodnějším uspořádáním bylo přesazení pětidenních semenáčků 1 cm nad rozhraní gelu obsahujícího 400 mM NaCl.
|
11
|
Bc.
Miroslava
Hanžlová
|
M2
|
MUDr. Ivan Šebesta, CSc.
|
Stanovení steroidních hormonů na systému LC-MS/MS
|
detail
Stanovení steroidních hormonů na systému LC-MS/MS
Steroidní hormony jsou lipofilní signální látky, které jsou syntetizovány ve steroidogenních žlázových buňkách kůry nadledvin a pohlavních žláz. V současnosti je popsáno mnoho poruch funkce těchto endokrinních žláz. Pro detailní diagnostiku je důležité stanovení hladin hormonů a prohormonů, které se liší od zdravé populace. Analýza steroidních hormonů má však svá specifika, která spočívají zejména v jejich nízkých koncentracích v krevním séru a existenci pouze velmi malých strukturních rozdílů mezi jednotlivými hormony. Cílem práce bylo navrhnout metodu stanovení steroidních hormonů pomocí kapalinové chromatografie ve spojení s tandemovou hmotnostní spektrometrií (LC-MS/MS) a porovnat ji s rutinně používanými imunoanalytickými metodami. Pomocí LC-MS/MS jsme nyní během jedné analýzy schopni stanovit 13 steroidních hormonů. Podařilo se prokázat, že mobilní fáze (MF) s přídavkem fluoridu amonného je v porovnání s běžně používanou MF s přídavkem mravenčanu amonného vhodnější pro měření a poskytuje vyšší odezvu detektoru. V současnosti vlastní analýze předchází dvoustupňová extrakce kapalina-kapalina, která by měla být do budoucna nahrazena metodou dvourozměrné (2D) LC-MS/MS bez extrakčního kroku. To by zkrátilo celkovou dobu analýzy a usnadnilo zařazení metody do klinické praxe.
|
12
|
Bc.
Barbora
Hlaváčová
|
M2
|
Ing. Jáchym Šuman, Ph.D.
|
Indukce genu pro bifenyl-2,3-dioxygenasu v půdní bakterii Pseudomonas alcaliphila sekundárními metabolity rostlin
|
detail
Indukce genu pro bifenyl-2,3-dioxygenasu v půdní bakterii Pseudomonas alcaliphila sekundárními metabolity rostlin
Schopnost bakterie přežít v daném prostředí se výrazně zvyšuje, pokud je schopna utilizovat netradiční zdroje uhlíku. Na druhou stranu se však také musí bránit vlivu toxických látek, které se v prostředí vyskytují. Ideální je tyto dvě schopnosti spojit a toxickou sloučeninu rozložit na látky, jež je bakterie schopna využít pro svou výživu. Další výhodou je, tentokrát už ne pro bakterii, pokud je touto toxickou sloučeninou nějaký organický polutant, který je tak díky bakteriální degradaci z prostředí odstraňován.
Příkladem podobného propojení je například bakterie Pseudomonas alcaliphilla JAB1, izolovaná z půdy z Jablonného nad Orlicí kontaminované polychlorovanými bifenyly (PCB). Kmen JAB1 je schopen degradovat PCB pomocí metabolické dráhy kódované tzv. bph operonem. Mezi induktory této dráhy patří bifenyl, což je ale, stejně jako PCB, látka antropogenního původu. Jak je možné, že degradace probíhá i v prostředí, kde bifenyl přítomen není? Odpověď lze nalézt výše a sice, že tato biodegradační dráha byla původně vyvinuta pro detoxifikaci sekundárních metabolitů rostlin (SMR). Cílem výzkumu je ověření této hypotézy a nalezení SMR, které budou indukovat expresi genů bifenylového operonu lépe než bifenyl. Výzkum může nalézt aplikaci nejen v dekontaminaci oblastí znečištěných PCB.
|
13
|
Bc.
Veronika
Horáková
|
M2
|
doc. Ing. Petra Lovecká, Ph.D.
|
Vliv oomycetního mycelia na biodegradaci polycyklických aromatických uhlovodíků
|
detail
Vliv oomycetního mycelia na biodegradaci polycyklických aromatických uhlovodíků
Polycyklické aromatické uhlovodíky (PAU) patří mezi široce rozšířené kontaminanty životního prostředí. Vzhledem k jejich hydrofobnímu charakteru mají sníženou biologickou dostupnost, což negativně ovlivňuje jejich biodegradaci. Cílem práce je potvrzení hypotézy o vlivu Pythium oligandrum na zvýšení biologické dostupnosti PAU a jeho účinku na pohyblivost bakterií schopných degradovat PAU. Z kontaminované zeminy na médiu s fenantrenem jako jediným zdrojem uhlíku bylo získáno 9 bakteríálních izolátů potencionálně schopných degradovat PAU. Na základě testu v médiu s nízkou koncentrací agaru byly tři z těchto izolátů určeny jako nepohyblivé. Pohyblivé izoláty patří na základě identifikace MALDI-TOF MS do řádu Burkholderiales.
Byly stanoveny kultivační podmínky vhodné, jak pro růst oomycety Pythium oligandrum, tak pro degradaci PAU izoláty. Za těchto podmínek byly provedeny duální testy izolátů a oomycety Pythium oligandrum, které prokázaly, že nedochází k inhibici růstu mezi Pythium oligandrum a žádným z izolátů. V další práci bude u izolátů stanovena účinnost degradace fenantrenu a směsi vybraných PAU, jejichž koncentrace bude stanovována HPLC DAD. S vybranými izoláty s různou pohyblivostí bude dále proveden test degradace fenantrenu a směsi PAU v přítomnosti Pythium oligandrum.
|
14
|
Bc.
Simona
Janičová
|
M2
|
doc. Ing. Petra Lovecká, Ph.D.
|
Izolácia biologicky aktívných látok rastliny Magnolia obovata
|
detail
Izolácia biologicky aktívných látok rastliny Magnolia obovata
V súčasnosti dochádza k rastúcemu záujmu o terapeutické využitie prírodných produktov pochádzajúcich z rastlín. Tieto rastliny syntetizujú sekundárne metabolity, ktoré majú širokú štruktúrnu rozmanitosť a sú považované za dôležité zdroje, ktoré majú potenciál pri výrobe farmaceutických prípravkov.
Bohatým zdrojom biologicky aktívnych látok je rod Magnolia, ktorej výťažky sú súčasťou kozmetických prípravkov, parfumov a doplnkov stravy vhodných pre zachovanie psychickej rovnováhy. V praxi sa doposiaľ využívajú extrakty získané zo sušenej a rozdrvenej kôry, u ktorej bol popísaný antiseptický, antioxidačný, anxiolitycký, protizápalový a protirakovinový účinok.
Cieľom našej práce bolo pripraviť extrakty z listov, kvetného obalu a pohlavných častí rastliny Magnolia obovata a stanoviť u nich biologickú aktivitu. U získaných extraktov bola testovaná antimikrobiálna aktivita na baktériách a kvasinkách s využitím diskovej difúznej metódy a spektrofotometrického merania rastu. Na základe doterajších testovaní, sme dospeli k záveru, že kvety a listy by mohli v porovnaní s kôrou rastliny predstavovať alternatívny a obnoviteľný zdroj biologicky aktívnych látok.
|
15
|
Bc.
Klára Žofie
Janoušková
|
M2
|
MUDr. Ivan Šebesta, CSc.
|
Buněčné linie s deficitem interferonového receptoru lambda 1 jako nástroj pro studium signalizace interferony lambda
|
detail
Buněčné linie s deficitem interferonového receptoru lambda 1 jako nástroj pro studium signalizace interferony lambda
Interferony lambda (IFNL) řadíme mezi signální molekuly imunitního systému. K jejich expresi dochází pouze v epitelových buňkách v důsledku virové infekce. Sekretované interferony se váží na heterodimerní membránový receptor složený z podjednotek IFNLR1 a IL-10R2. Navázání interferonu spouští JAK-STAT signální dráhu, která vede k aktivaci transkripce interferon senzitivních genů. IFNL1 až 3 tímto mechanismem stimulují protivirovou odpověď. IFNL4 rovněž aktivuje JAK-STAT dráhu stejně jako IFNL1-3, avšak současně brání spontánní eliminaci viru hepatitidy C. Tento paradox společně s dalšími odlišnostmi, jako je například nižší extracelulární sekrece IFNL4 v porovnání s ostatními IFNL, vyvolává úvahy o možném působení IFNL4 jako intracelulární signální molekuly. Za účelem studia těchto zatím neznámých hypotetických nekanonických signálních drah IFNL4 jsme pomocí metody editace genomu CRISPR/Cas9 vyvinuli buněčné linie deficitní pro IFNLR1. V deficitních i kontrolních liniích transfekovaných IFNL3 nebo IFNL4 jsme u buněk transfekovaných IFNL4 pozorovali jadernou lokalizaci IFNL4. Jaderná lokalizace IFNL3 u IFNL3 transfekovaných buněk nebyla detekovatelná.
|
16
|
Nikola
Jelenová
|
B3
|
Ing. Jitka Viktorová, Ph.D.
|
Snižuje genová manipulace ječmene toxicitu způsobenou nepříznivými podmínkami?
|
detail
Snižuje genová manipulace ječmene toxicitu způsobenou nepříznivými podmínkami?
Světové zemědělství v posledních dekádách reaguje na globální změny a geneticky modifikované plodiny získávají čím dál více na významu. Ovšem na evropském trhu stále panují obavy z jejich konzumace.
Hlavním problémem zemědělských plodin jsou plísně, zasolení půdy a sucho. Rostliny jako ochranu před stresem syntetizují sekundární metabolity, které způsobují toxicitu a tím případné nebezpečí pro konzumenty. Rekombinantní produkcí osmoprotektivních a antifungálních proteinů, které aktivují rostlinný imunitní systém, se plodiny lépe připraví na stresové podmínky. Prokázáním, že transgenní rostliny jsou méně toxické po tom, co jsou vystaveny nepříznivým vnějším podmínkám, by mohlo vést k vyvrácení mnohých stereotypů. Jako modelová rostlina byl použit ječmen setý, který byl geneticky upraven pro nadprodukci proteinu osmotin a během pěstování byl vystaven plísni Fusarium a 200mM NaCl. Druhá linie ječmene nadprodukovala peptid limen a byla kultivována v přítomnosti spor plísně Fusarium. V rámci bakalářské práce byly testovány methanolové extrakty obou linií ječmene po vystavení rostlin stresu, a to na třech buněčných liniích HaCaT, HEK 293 a HDF2 v pěti různých koncentracích a pomocí fluorescenční metody byla zjištěna viabilita nenádorových buněk, respektive akutní toxicita extraktů.
|
17
|
Bc.
Monika
Kalousková
|
M2
|
Ing. Barbora Holubová, Ph.D.
|
Vývoj imunochemické metody pro detekci syntetické drogy pyrovaleronu
|
detail
Vývoj imunochemické metody pro detekci syntetické drogy pyrovaleronu
Nové syntetické drogy mají velmi podobný psychoaktivní účinek jako nelegální drogy. Tyto látky jsou syntetizovány za účelem obejít stávající legislativu – jejich struktura je velmi podobná nelegálním drogám s nepatrnými změnami. Předmětem této studie je vývoj rychlé imunochemické metody pro detekci pyrovaleronu (zástupce syntetických kathinonů). Doposud nebyla vynalezena pro tuto drogu žádná snadná a rychlá screeningová metoda, která by mohla pomoci odhalit tuto látku v oblastech jako je lékařství a policie.
Cílem práce je vyvinout nepřímý kompetitivní formát ELISA pro detekci pyrovaleronu. Na základě sestavených titračních křivek pomocí 4 králičích polyklonálních protilátek a dvou imobilizačních konjugátů (RJ3-BSA a RJ3-RSA) byla vybrána přijatelná kombinace protilátky (Pl 298, 2,5 μg/ml) a konjugátu (RJ3-BSA, 50 ng/ml) a sestavena kalibrační křivka. V dalších experimentech byly vybírány příhodné podmínky metody (různé složení pufrů pro protilátky, teplota a doba inkubací). S optimalizovanou metodou bylo dosaženo I50 0,30 ± 0,08 ng/ml.
V navazující práci bude testována specifita použité protilátky v ELISA pomocí křížových interakcí.
|
18
|
Bc.
Sofia
Kolesnikova
|
M2
|
prof. Ing. Martin Fusek, CSc.
|
Multimerization rules for G-quadruplexes
|
detail
Multimerization rules for G-quadruplexes
G-quadruplexes can multimerize under certain conditions, but the sequence requirements of such structures are not well understood. In this study, we investigated the ability of all possible variants of the central tetrad in a monomeric, parallel-strand G-quadruplex to form higher-order structures. Although most of these 256 variants existed primarily as monomers under the conditions of our screen, ∼10% formed dimers or tetramers. These structures could form in a wide range of monovalent and divalent metal ions, and folding was highly cooperative in both KCl and MgCl2. As was previously shown for G-quadruplexes that bind GTP and promote peroxidase reactions, G-quadruplexes that form dimers and tetramers have distinct sequence requirements. Some mutants could also form heteromultimers, and a second screen was performed to characterize the sequence requirements of these structures. Taken together, these experiments provide new insights into the sequence requirements and structures of both homomultimeric and heteromultimeric G-quadruplexes.
|
19
|
Bc.
Veronika
Kovandová
|
M2
|
Ing. Sabina Purkrtová, Ph.D.
|
Využití MALDI-TOF MS pro identifikaci a typizaci bakterií skupiny Enterobacter cloacae komplex
|
detail
Využití MALDI-TOF MS pro identifikaci a typizaci bakterií skupiny Enterobacter cloacae komplex
Rod Enterobacter patří mezi významné rody čeledi Enterobacteriaceae a zahrnuje 22 druhů. Druhy E. asburiae, E. cloacae, E. hormaechei, E. kobei, E. ludwigii si jsou na genetické i fenotypové úrovni natolik podobné, že jsou řazeny do druhové skupiny označované jako Enterobacter cloacae komplex. Tyto druhy jsou ubikvitně rozšířeny v životním prostředí. Řadí se poté k častým kontaminantům potravin, kde způsobují kažení, a jsou i častými původci nozokomiálních infekcí. Pro stanovení zdrojů kontaminace a infekce je proto důležitá přesná identifikace na úrovni druhu, příp. poddruhu a typizace na úrovni kmene. Tato identifikace v praxi dostupnými standardními metodami je však poměrně obtížná, až nemožná. Cílem této práce bylo stanovení spolehlivosti standardních postupů identifikace Enterobacter cloacae komplex metodami ENTEROtest 24 N a MALDI-TOF MS s použitím software Bruker Biotyper. Pro odlišení proteinových profilů E. cloacae a E. hormachei a jejich typizaci byly vytvořeny a srovnány různé klasifikační modely. K vytvoření modelů byly použity software mMass, ClinPro Tools a proteinové profily sbírkových kmenů získané třemi metodami přípravy vzorku. Vybrané modely umožnily stanovit druhově specifické markery a byly následně použity pro identifikaci potravinových izolátů.
|
20
|
Bc.
Hana
Kočí
|
M2
|
Ing. Jiří Suttnar, CSc.
|
Interakce proteinů normální plazmy s plazmou onkohematologických pacientů
|
detail
Interakce proteinů normální plazmy s plazmou onkohematologických pacientů
Myelodysplastický syndrom (MDS) je onemocnění krvetvorby charakterizované nedozráváním kmenových buněk, či dysplazií. Cílem práce bylo vytvořit nástroj pro výzkum a diagnostiku tohoto onemocnění v plazmě s využitím optické metody SPR (Surface Plazmon Rezonance), která se využívá k charakterizaci biomolekulárních interakcí. Pomocí vazebné a afinitní konstanty umožňuje zjistit množství vázajícího proteinu a jeho stabilitu. Místo interakčních partnerů pro markery MDS byly na SPR čip imobilizovány frakce zdravé plazmy. Tyto frakce byly připraveny třemi způsoby: gelovou chromatografií, deplecí s následnou gelovou chromatografií a pomocí ProteoMineru s následnou gelovou chromatografií. Metoda SPR měla dvě hlavní části: imobilizace frakcí normální plazmy na čip a samotná detekce protein-protein interakcí. Analyzovali jsme vzorky MDS pacientů a zdravé kontroly. Jako nejvhodnější způsob přípravy frakcí plazmy pro SPR se jeví samotná gelová chromatografie a varianta deplece – gelová chromatografie. V pilotních experimentech byly zjištěny rozdíly v interakcích imobilizovaných frakcí plazmy se vzorky plazmy pacientů v různých stadiích MDS a se vzorky plazmy zdravých dárců. Získaná data budou využita k profilování MDS pacientů pomocí SPR imagingu, kdy lze analyzovat více vzorků souběžně.
|
21
|
Bc.
Hana
Kratochvilová
|
M2
|
Ing. Hana Stiborová, Ph.D.
|
Dlouhodobý vliv různých typů hnojení na půdní mikrobiom
|
detail
Dlouhodobý vliv různých typů hnojení na půdní mikrobiom
Dlouhodobé hnojení zemědělských půd může ovlivnit půdní mikrobiální společenství a tedy i aktivitu extracelulárních enzymů, které se podílejí na rozkladu organických látek. Cílem této práce je stanovit vliv různých typů hnojení na i) aktivitu enzymů, a na ii) počet funkčních genů pro enzymy účastnící se koloběhu dusíku. Pro měření byly použity vzorky z lokality Humpolec periodicky hnojené již od roku 1996 i) odpadním kalem, ii) trojnásobným množstvím odpadního kalu, iii) statkovým hnojem, iv) minerálním hnojivem (NPK) a v) kontrola bez hnojení. Pro srovnání biologické aktivity půd byly vybrány 4 extracelulární enzymy: β‑glukosidasa, β‑xylosidasa, kyselá fosfatasa a β‑N‑acetylhexosaminidasa. Kinetika enzymových reakcí byla měřena pomocí fluorogenních substrátů a ze získaných závislostí byly vypočítány kinetické parametry KM a Vmax. Dále bude provedena statistická korelace těchto parametrů s fyzikálně-chemickými parametry jednotlivých půd. Počet funkčních genů bude stanoven metodou qPCR a to pomocí absolutní i relativní kvantifikace (vztaženo na gen pro 16S rRNA). TA klonováním byl připraven standard genu nosZ, který kóduje katalytickou podjednotku reduktasy oxidu dusného. Dále budou připraveny standardy pro nitrát reduktasu (narG), fixaci dusíku (nifH) a oxidaci amoniaku (amoA).
|
22
|
Bc.
Alžběta
Kropáčková
|
M2
|
MUDr. Ivan Šebesta, CSc.
|
Stanovení thyreoidálních hormonů na systému LC-MS/MS
|
detail
Stanovení thyreoidálních hormonů na systému LC-MS/MS
Stanovení hladiny tyreoidálních hormonů je důležitým diagnostickým nástrojem pro odhalení chorob štítné žlázy. V současné době se pro rutinní analýzu v laboratořích klinické biochemie využívají imunochemické automatické analyzátory s převážně chemiluminiscenční detekcí.
Za zlatý standard je ale považována selektivní a specifická metoda LC/MS/MS, která v porovnání s imunoanalytickými metodami nabízí řadu výhod, např. možnost stanovení více analytů současně během jedné analýzy nebo vyloučení zkřížené reakce s používanými protilátkami jako u imunoanalýzy. To LC/MS/MS metodu upřednostňuje zvlášť při vyšetření štítné žlázy v těhotenství, kde dochází k změnám v hladinách vazebných proteinů oproti běžné populaci.
Pomocí LC/MS/MS byly stanoveny hormony tyroxin (T4) a trijodtyronin (T3) ve volné i vázané formě ze séra pacientů. Před vlastním stanovením bylo nutné provést ultrafiltraci a extrakci analytů z matrice. Pro analýzu byl využit přístroj Agilent 6490 Triple Quadrupole LC/MS systém s analytickou kolonou Agilent Poroshell 120 EC-C18. Při tomto postupu nebylo dosaženo dostatečné citlivosti pro detekci volných tyreoidálních hormonů. LOD se pohyboval okolo 40 pmol/l. Dostatečnou citlivosti by mohla poskytnout metoda 2D-LC/MS/MS spojená s SPE, která je v současnosti testována.
|
23
|
Bc.
Karolína
Krubnerová
|
M2
|
Ing. Jiří Suttnar, CSc.
|
Metabolity tryptofanu a oxidační stres v plasmě pacientů s kardiovaskulárním onemocněním
|
detail
Metabolity tryptofanu a oxidační stres v plasmě pacientů s kardiovaskulárním onemocněním
Esenciální aminokyselina tryptofan může být v lidském těle metabolizována několika cestami. Hlavní cestou degradace je tzv. kynureninová cesta. Při určitých patofyziologických stavech je v extrahepatálních buňkách první oxidační krok vedoucí ke vzniku formylkynureninu katalyzován indolamin-pyrrol-2,3-dioxygenasou. Zvýšená koncentrace kynureninů je spojována s rizikem vzniku akutních koronárních syndromů, jako jsou nestabilní angina pectoris, akutní infarkt myokardu a další. Tato onemocnění jsou provázena oxidačním stresem, který je často charakterizován stanovením malondialdehydu (MDA) v krevní plasmě.
Ke stanovení metabolitů tryptofanu v plasmě zdravých dárců jsme použili HPLC s detekcí pomocí tandemového hmotnostního spektrometru pracujícího v režimu sledování vybraných reakcí. Bylo testováno několik kolon, kdy nejlepší výsledky poskytovala kolona Atlantis T3 (Waters, Česká republika). Pro přímé stanovení MDA jsme navrhli HPLC metodu s využitím kolony Zic-Hilic (Merck, Česká republika), kterou porovnáme s HPLC metodou využívající derivatizaci MDA 2,4-dinitrofenylhydrazinem. Pomocí uvedených metod budou stanoveny koncentrace tryptofanových metabolitů a MDA v plasmě pacientů s kardiovaskulárním onemocněním a v plasmě kontrolní skupiny zdravých dárců.
|
24
|
Bc.
Jana
Kubíková
|
M2
|
doc. Ing. Vojtěch Spiwok, Ph.D.
|
Identifikace somatických mutací v nádorech
|
detail
Identifikace somatických mutací v nádorech
Dlaždicobuněčný karcinom hlavy a krku je v ČR podle údajů ČSÚ příčinou zhruba 800 umrtí ročně, což představuje přibližně 3% všech úmrtí na rakovinu. V našem souboru máme 18 pacientů s tímto onemocněním, u nichž byla sekvenována DNA z normální a nádorové tkáně, s cílem nalézt mutace, které vedly k rozvoji onemocnění.
DNA sekvenování nové generace je v současnosti již dobře zavedenou procedurou a pro zpracování sekvenačních dat existuje řada standardních nástrojů. Přesto vlastní analýza není triviální záležitostí. Už jen velikost zpracovávaných dat obvykle přesahuje možnosti běžných počítačů. Proto jsme se rozhodli postup vyzkoušet nejprve na publikovaném datasetu s verifikovanými výsledky. Výstupní data ze sekvenátoru jsme v několika krocích očistili a srovnali s referenčním genomem. U jednotlivých pacientů jsme pak porovnali nádorové vzorky vůči normálním, nenádorovým. Analýzu jsme provedli za pomoci dostupných bioinformatických nástojů a vlastních striptů v programovém prostředí R. Tímto postupem se podařilo replikovat publikované výsledky a identifikovat popsanou mutaci. Můžeme ho tedy v další fázi použít pro naše data.
|
25
|
Bc. et Bc.
Jan
Kuderna
|
M2
|
Ing. Jan Lipov, Ph.D.
|
Výběr sledovaných a referenčních genů pro studium osteodiferenciace kmenových buněk
|
detail
Výběr sledovaných a referenčních genů pro studium osteodiferenciace kmenových buněk
Stárnoucí populace se stále častěji potýká se zdravotními problémy způsobenými zlomeninami, následky osteopórozy či jinými kostními defekty. Biomateriály třetí generace jsou vhodnou alternativou k jejich léčbě, jelikož jsou schopné vyvolání specifické odpovědi na molekulární úrovni v podobě stimulace migrace, proliferace a především diferenciace mezenchymálních kmenových buněk (MSC) na zralé osteoblasty. Tato práce se nejprve zaměřuje na sledování samotné osteodiferenciace indukované osteodiferenciačním médiem. Testovanou kulturou jsou imortalizované MSC, od kterých se očekává, že po stimulaci tímto médiem budou exprimovat řadu specifických genů. Mezi těmi byl vybrán kolagen typu I, osteokalcin, osteopontin, alkalická fosfatasa a transkripční faktor Runx2. Sledováním relativní míry transkripce těchto osteodiferenciačních markerů pomocí kvantitativní PCR s reverzní transkripcí lze poté potvrdit, zdali k osteodiferenciaci skutečně dochází. Stěžejním krokem je výběr vhodných referenčních genů, ze kterých postoupí do užšího výběru minimálně dva až tři s nejstabilnější expresí. Těmi je prozatím TATA vazebný protein, 14-3-3 protein zeta/delta a β-glukuronidasa. V budoucnu by se práce měla zaměřit na testování osteoindukčního potenciálu nanostrukturovaných titanových materiálů.
|
26
|
Bc.
Maria
Kuzmina
|
M2
|
Ing. Jaroslav Zelenka, Ph.D.
|
Testování potenciální antidiabetické a protizánětlivé aktivity syntetických a přírodních látek
|
detail
Testování potenciální antidiabetické a protizánětlivé aktivity syntetických a přírodních látek
Zánět představuje typickou obrannou reakci organismu, se kterou se každý z nás během svého života několikrát setká. Jedná se o komplexní biologickou odpověď na přítomnost patogenu a poškození tkáně. Zatímco akutní zánět pomáhá k překonání infekce a zhojení tkáně, chronický zánět je patologický jev, který stojí za vznikem mnoha chorob včetně diabetu typu II. Tato práce se zabývá testováním vlivu laktátového aniontu, pH a doby jejich expozice. Jako aktivátor zánětu byl použit bakteriální lipopolysacharid, který interaguje s makrofágy a vyvolává produkci dusíkatých a kyslíkových radikálu a zároveň též cytokinů. Produkce reaktivních kyslíkových/dusíkatých sloučenin byla měřena spektrofotometricky s využitím Griessovy metody a NBT (Nitroblue Tetrazolium) testu. Dosavadní výsledky ukazují, že krátkodobá expozice laktátového aniontu podobně jako lehce snížené pH vykazují protizánětlivé účinky, zatímco dlouhodobá expozice účinkuje prozánětlivě.
|
27
|
Bc.
Jana
Kvízová
|
M2
|
Ing. Silvie Rimpelová, Ph.D.
|
Konjugace cyproteron acetátu s fotosensitizéry za účelem cílené léčby rakoviny prostaty
|
detail
Konjugace cyproteron acetátu s fotosensitizéry za účelem cílené léčby rakoviny prostaty
Cyproteron acetát (CPA) je antiandrogen využívaný k léčbě rakoviny prostaty, kterou však doprovází řada nežádoucích účinků. Ty se dají minimalizovat systematickou léčbou. Příkladem takové léčby je fotodynamická terapie (PDT) založená na aplikaci fotosenzitizéru (PS), který může být navíc specificky cílen, a tak se přednostně akumuluje v nádorové tkáni. Po aktivaci světlem vyvolává PS vznik reaktivních forem kyslíku destruujících nádor. V buňkách rakoviny prostaty je nadexprimován gen pro androgenní receptor (AR), na který se CPA specificky váže, můžeme ho tak využít k cílení PS do nádorových buněk.
Cílem práce bylo studium intracelulární lokalizace a fototoxicity konjugátů CPA s BODIPY a purpurinem 18. Použita byla fluorescenční mikroskopie živých buněk s komerčně dostupnými značkami buněčných organel. Dále byla stanovena toxicita konjugátů in vitro bez fotoaktivace a po aktivaci světlem.
Konjugát CPA s purpurinem 18 (4) vykazoval vyšší inhibici proliferace buněk
PC-3 (IC50=0,4 µmol·l-1) i LNCaP (IC50=0,05 µmol·l-1.) oproti samotnému purpurinu 18 a na rozdíl od konjugace s BODIPY (8). Látka 4 se lokalizovala v endoplazmatickém retikulu a mohla by mít potenciální využití v PDT, a to zejména díky její vysoké akumulaci v nádorových buňkách a velké fototoxicitě.
|
28
|
Bc.
Kristýna
Káňová
|
M2
|
prof. Ing. Tomáš Macek, CSc.
|
Metabolity II. fáze derivátů kvercetinu: srovnávací studie
|
detail
Metabolity II. fáze derivátů kvercetinu: srovnávací studie
Rostlinné polyfenoly a především flavonoidy jsou sekundárními metabolity rostlin s vysokou biologickou aktivitou a příznivými účinky na lidské zdraví. V lidském těle však vykazují nízkou biodostupnot a jsou rychle metabolizovány převážně konjugačními reakcemi jako je sulfatace. Sulfáty kvercetinu a jeho derivátů jsou důležité autentické standardy pro metabolické studie. Důležitá je tedy optimalizace jejich přípravy a purifikace v laboratorních podmínkách. Sulfáty luteolinu, myricetinu a ampelopsinu byly připraveny za pomocí enzymu arylsulfotransferasy z Desulfitobacterium hafniense heterologně exprimované v E. coli. Takto připravené mono- a disulfáty byly podrobeny HPLC, MS a NMR analýze a následně byly testovány na schopnost zhášet DPPH (1,1-difenyl-2-pikrylhydrazyl), ABTS (2,2´-azinobis-(3-etylbenzotiazolin-6-sulfonová kyselina)) a DMPD+ (N,N-dimethyl-p-fenylendiamin) radikál, a také na schopnost redukce železitých iontů v porovnání s výchozími látkami. Jednotlivé metabolity se v aktivitě výrazně lišily a tento rozdíl byl pozorován také u jednotlivých isomerů monosulfátů. Výsledky testů tedy potvrzují, že sulfatace výrazně ovlivňuje biologickou aktivitu luteolinu, myricetinu a ampelopsinu.
|
29
|
Bc.
Lucie
Leňková
|
M2
|
Ing. Ludmila Karamonová, Ph.D.
|
Subfrakcionace membrán bakterií rodu Cronobacter a charakterizace přítomných proteinů pomocí hmotnostní spektrometrie a imunoblotu
|
detail
Subfrakcionace membrán bakterií rodu Cronobacter a charakterizace přítomných proteinů pomocí hmotnostní spektrometrie a imunoblotu
Bakterie rodu Cronobacter se řadí mezi oportunní patogeny, které jsou spojované s alimentárními a nozokomiálními infekcemi. Rizikovými skupinami jsou především novorozenci a imunodeficientní jedinci. Onemocnění způsobená bakteriemi tohoto rodu nejsou příliš častá, mají však vysokou letalitu, která v případě novorozeneckých meningitid dosahuje až osmdesáti procent. Virulentní faktory účastnící se patogeneze těchto bakterií nejsou v současné době dostatečně popsány. Identifikace potenciálně virulentních proteinů by mohla přispět k objasnění procesu patogeneze těchto bakterií. Následně by také mohla sloužit pro vývoj specifických imunochemických identifikačních metod jako je například metoda ELISA.
V rámci této práce byly dvakrát nezávisle izolovány frakce vnější membrány, vnitřní membrány a periplazmy vybrané sady zástupců rodu Cronobacter. Jednotlivé frakce byly charakterizovány pomocí SDS-PAGE a imunoblotu, za použití protilátek proti celým buňkám a proti jednotlivým membránovým frakcím prokazatelně patogenního kmene Cb35.
Proteiny membránových frakcí byly identifikovány pomocí hmotnostní spektrometrie (LC-ESI-Q-TOF MS). U všech identifikovaných proteinů byla prostřednictvím in silico analýzy určena jejich buněčná lokalizace.
|
30
|
Bc.
Lucie
Loskotová
|
M2
|
Ing. Martin Janda, Ph.D.
|
Faktory ovlivňující akumulaci kalosy v rostlinách Arabidopsis thaliana
|
detail
Faktory ovlivňující akumulaci kalosy v rostlinách Arabidopsis thaliana
Kalosa, 1,3-β-glukan, je lineární polysacharid vyskytující se v buněčné stěně rostlin. Kalosa se v rostlině podílí na některých základních biologických procesech, jakým je například dělení buněk. Současně hraje roli v odpovědi rostliny na abiotický či biotický stres. I přes nezpochybnitelnou důležitost kalosy nebyla její akumulace dosud zcela prostudována. V této práci se zaměřujeme na akumulaci kalosy v závislosti na stáří rostliny Arabidopsis thaliana (huseníček rolní). Dále se věnujeme úloze, kterou mají fytohormon kyselina salicylová a enzym kalosasynthasa 12 v akumulaci kalosy závislé na stáří A. thaliana. Za tímto účelem používáme jak divoký typ, tak mutantní rostliny A. thaliana. Analyzujeme semenáčky pěstované za sterilních podmínek a také rostliny pěstované v zemině.
|
31
|
Bc.
Martina
Lustová
|
M2
|
Ing. Petra Junková, Ph.D.
|
Interakce matrixového proteinu HIV-1 s fosfolipidy buněčné membrány
|
detail
Interakce matrixového proteinu HIV-1 s fosfolipidy buněčné membrány
Matrixový protein (MA) tvořící N-terminální doménu polyproteinu Gag hraje u viru HIV významnou roli při transportu polyproteinu Gag k buněčné membráně. MA též zajišťuje interakci s membránou, čímž je iniciována tvorba virových částic a jejich pučení z hostitelské buňky. V předchozích studiích bylo zjištěno, že pro vazbu MA na membránu je zásadní jeho myristoylace a interakce vysoce bazického regionu s fosfatidylinositol-4,5-bisfosfátem (PI-4,5-P2). K vazbě též přispívá fosfatidylserin (PS).
Tato práce je zaměřena na odhalení interakčního rozhraní mezi MA a PS. Metodou povrchového mapování, která je založena na detekci specifických kovalentních modifikací dostupných aminokyselin prostřednictvím hmotnostní spektrometrie, jsou studovány změny povrchové dostupnosti vybraných aminokyselin (lysin, tryptofan a tyrosin) po vazbě MA na liposomy obsahující PS.
Změny v dostupnosti po interakci s liposomy byly detekovány u lysinů a tryptofanů, což může značit jejich možné zapojení do interakce s PS. V případě lysinů byly, stejně jako u liposomů obohacených o PI-4,5-P2, detekovány změny v první bazické oblasti, avšak interakce mezi lysiny a PS se nezdá být tak specifická jako v případě PI-4,5-P2. Naproti tomu výsledky modifikací tyrosinů neposkytují indicie o jejich zapojení do interakce.
|
32
|
Bc.
Barbora
Miklasová
|
M2
|
Ing. Kamila Zdeňková, Ph.D.
|
DNA analýza potravinářsky významných mikromycet produkujících patulin a ochratoxin A
|
detail
DNA analýza potravinářsky významných mikromycet produkujících patulin a ochratoxin A
Při produkci potravin může docházet k jejich napadení mikromycetami. Ty nejenže znehodnocují potravinu jako takovou, ale také mohou produkovat toxiny. Patulin a ochratoxin A (OTA) jsou mykotoxiny s hepatotoxickými, imunosupresivními a potenciálně i karcinogenními účinky, produkované zejména mikromycetami rodů Aspergillus a Penicillium. Tyto mikromycety lze detekovat např. pomocí molekulárně biologických metod, tato práce je zaměřena na PCR a LAMP (Loop-Mediated Isothermal Amplification). Naším cílem je tedy navrhnout takové PCR a LAMP protokoly, pomocí kterých bude možné bezpečně rozlišit, zda jsou přítomné mikromycety schopny produkovat patulin či OTA. Poněvadž je syntéza mykotoxinů typicky vícekroková, byly pro práci vybrány klíčové enzymy biosyntetické dráhy obou mykotoxinů, konkrétně polyketid-synthasa (PKS) pro OTA a isoepoxydondehydrogenasa (IDH) pro patulin.
Doposud se podařilo izolovat DNA z mikromycet získaných ze sbírek VŠCHT, dále bude pomocí PCR ověřena jeho amplifikovatelnost a poté bude experimentálně ověřen protokol pro detekci genů kódujících klíčové enzymy biosyntetických drah obou mykotoxinů.
|
33
|
Patricie
Niemcová
|
M1
|
doc. Ing. Petra Lovecká, Ph.D.
|
Endofytní mikroorganismy v ochraně rostlin
|
detail
Endofytní mikroorganismy v ochraně rostlin
Zemědělství je majoritním producentem plodin dnešní populace. Zvýšená poptávka vede k využívání velkého množství chemických pesticidů a dalších opatření, které vedou k narušování ekosystému. Jednou z možností alternativního řešení je využití endofytních bakterií jako metodu biologické kontroly. Vybrané bakteriální izoláty izolované z řepky, z listů a kořenů topolu a ze zeminy byly identifikovány pomocí hmotnostní spektrometrie MALDI – TOF. Obsahem práce bylo zjištění antifungální aktivity vůči vybraným mikromycétním houbám (Sclerotinium sclerotiorum, Trichoderma harzianum, Rhizoctonia solani, Sphaerodes simicola, Fusarium oxysporum) metodou duálního růstového testu. Další problematikou bylo ověření účinnosti antifungální aktivity endofytních izolátů proti rostlinnému patogenu Leptosphaeria maculans napadající čeleď Brassicaceae, které probíhalo měřením relativní fluorescence geneticky upraveného patogenu.
|
34
|
Bc.
Denisa
Nikodemová
|
M1
|
Ing. Petr Svoboda
|
Intracelulární lokalizace visfatinu u makrofágů U937
|
detail
Intracelulární lokalizace visfatinu u makrofágů U937
Protein visfatin se v organismu nachází v intracelulárním i extracelulárním prostředí. Přestože má visfatin v extracelulárním prostředí několik funkcí, není objasněn mechanismus jeho sekrece. Předpokládá se, že je secernován některou z neklasických sekrečních drah. Jako zdroj extracelulární formy visfatinu jsou označovány adipocyty, hepatocyty a makrofágy. Avšak naše předchozí práce prokázaly aktivní sekreci visfatinu pouze u buněk imunitního systému. Cílem práce bylo získání nových poznatků ohledně intracelulární lokalizace visfatinu u U937 makrofágů, se záměrem objasnit mechanismus jeho sekrece.
Pro určení intracelulární lokalizace visfatinu byla připravena linie U937 se stabilní produkcí visfatinu ve fúzi se zeleným fluorescenčním proteinem (GFP-visfatin). U této linie byla ověřena syntéza a aktivní sekrece GFP-visfatinu pomocí imunoblotu. Fluorescenční mikroskopií na fixovaných i nativních buněčných preparátech byla sledována intracelulární lokalizace GFP-visfatinu, který se nacházel převážně v cytoplasmě a poblíž cytoplasmatické membrány. Dále bylo zjištěno, že se visfatin nachází ve váčcích, které se uvolňovaly z buněk. Výsledky naznačují, že makrofágy aktivně sekretují visfatin pomocí transportních váčků.
|
35
|
Bc.
Klára
Novotná
|
M2
|
Ing. Kamila Zdeňková, Ph.D.
|
Vliv nanočástic na extracelulární matrici biofilmu Staphylococcus aureus a na transkripci genů kódujících modulíny
|
detail
Vliv nanočástic na extracelulární matrici biofilmu Staphylococcus aureus a na transkripci genů kódujících modulíny
Grampozitivní bakterie Staphylococcus aureus je nebezpečný oportunní patogen, který kolonizuje kůži a povrchy sliznic člověka a dalších savců. Je schopná tvořit biofilm, což má často za následek vznik chronických infekcí vznikajících po hospitalizaci pacienta v nemocnici. Biofilm se může také tvořit na katetrech, implantátech či kloubních náhradách. Proto je důležité se zabývat mechanismy odstranění biofilmů či zabránění jejich růstu. Součástí těchto biofilmů jsou amyloidní proteiny zvané modulíny rozpustné ve fenolu (PSM), které v biofilmu zastávají významné funkce. Práce je zaměřena právě na studium biofilmu vybraných kmenů S. aureus ze sbírky ZL ÚBM. Vizualizace biofilmu i PSM je prováděna pomocí mikroskopických metod. Metodou CTAB byla izolována DNA vybraných bakteriálních kmenů S. aureus a jednotlivé PSM byly amplifikovány metodou PCR.
Stříbrné i zlaté nanočástice vykazují antimikrobiální aktivitu proti bakteriím a mikromycetám. Pro úspěšnou aplikaci nanočástic jako antibakteriálních agens je nezbytné porozumět jejich vlivu nejen na bakteriální buňky, ale i na biofilmy. V této práci bude studován vliv stříbrných a zlatých nanočástic na adhezi buněk a tvorbu biofilmu S. aureus. Dále se bude ověřovat vliv nanočástic na hladinu transkripce genů PSMα a PSMβ.
|
36
|
Bc.
Radim
Novotný
|
M2
|
Ing. Jan Prchal, Ph.D.
|
Hledání nových interakčních partnerů matrixového proteinu Mason-Pfizerova opičího viru
|
detail
Hledání nových interakčních partnerů matrixového proteinu Mason-Pfizerova opičího viru
Masonův-Pfizerův opičí virus (M-PMV) je retrovirus a důležitý modelový organismus pro studium životního cyklu retrovirů. V jeho životním cyklu hraje klíčovou roli N-terminální doména Gag polyproteinu, matrixový protein (MA), který zprostředkovává transport nezralé virové částice uvnitř buňky a její následnou interakci s buněčnou membránou. Většina retrovirových MA je N-terminálně myristoylována. Myristoyl slouží jako signál pro cílení virové částice k membráně a jako kotva pro interakci s membránou. Nalezení nových proteinů hostitelské buňky interagujících s MA by mohlo přispět k bližšímu objasnění procesu transportu uvnitř hostitelských buněk a interakce s buněčnou membránou.
V rámci této práce byl proveden s myristoylovaným a nemyristoylovaným MA GST-pull-down proti lyzátům buněk linií COS-1, HeLa a HEK 293T. Interagující proteiny byly identifikovány pomocí hmotnostní spektrometrie.
Z analýzy vzešel jako zajímavý interakční partner vakuolární třídící protein 28 (VPS28). Jedná se o jednu ze tří podjednotek komplexu ESCRT-I, který hraje nezbytnou roli v řadě procesů včetně pučení virů. VPS28 byl připraven rekombinantně a jeho interakce s MA je ověřována pomocí NMR spektroskopie.
|
37
|
Bc.
Ondřej
Novotný
|
M2
|
doc. Ing. Mgr. Štěpánka Kučková, Ph.D.
|
Rozlišení mléčných materiálů používaných v historických objektech pomocí hmotnostní spektrometrie
|
detail
Rozlišení mléčných materiálů používaných v historických objektech pomocí hmotnostní spektrometrie
Malta je stavební materiál tvořený v základu plnivem, pojivem a vodou. Kvůli zlepšení vlastností malty se, hlavně v závislosti na zeměpisné oblasti a na dostupném materiálu, v průběhu historie používala aditiva (přídavky do 5 % celkové hmotnosti) jako krev, rýžový škrob, vajíčka nebo mléko. V průběhu času se ale přesná technologie přípravy malty nedochovala a dnes syntetické náhražky aditiv nedosahují takové životnosti, nebo kvality, jakou se vyznačují dochované vzorky. Tato práce se zabývá rozlišením proteinů z mléčných aditiv přidávaných do malt. Štěpením pomocí enzymu trypsinu a následným měřením izolovaných peptidů na přístroji MALDI-TOF se pokoušíme analýzou hlavních komponent (PCA) rozlišit od sebe jednotlivá mléčná aditiva, v našem případě plné mléko, kasein, tvaroh a syrovátku. Z důvodu nespecifického štěpení a degradace proteinů, způsobeném alkalickým prostředím v maltě, povětrnostními podmínkami a stárnutím, zkoumáme rozlišení proteinů v referenčních materiálech, v modelových maltách z referenčních materiálů a s reálnými historickými vzorky. Dosavadní výsledky prokázaly možnost spolehlivého rozlišení referenčních materiálů a podobné výsledky očekáváme i u porovnání modelových a historických malt.
|
38
|
Bc.
Jakub
Papík
|
M2
|
Ing. Iva Pichová, CSc.
|
Analýza obsahu vakuol a lipidových tělísek kvasinek Candida albicans a Saccharomyces cerevisiae pomocí Ramanovy spektroskopie
|
detail
Analýza obsahu vakuol a lipidových tělísek kvasinek Candida albicans a Saccharomyces cerevisiae pomocí Ramanovy spektroskopie
Candida albicans je oportunně patogenní kvasinka, která je běžnou součástí mikroflóry zdravého člověka. V případě oslabení imunitního systému může způsobit infekce nazývané kandidózy. C. albicans je díky flexibilnímu metabolismu schopná přežívat za nepříznivých nutričních podmínek a odolávat stresům, kterým je vystavena v hostitelském prostředí. Důležitou roli v těchto procesech hrají zásobní buněčné kompartmenty kandid: vakuoly a lipidová tělíska.
Pomocí Ramanovy mikrospektroskopie jsme porovnali chemické složení vakuol a lipidových tělísek dvou příbuzných kvasinek: Saccharomyces cerevisiae a C. albicans. Kvasinky byly kultivovány buď v médiu bohatém na dusík, nebo za nedostatku dusíku.
Z Ramanových spekter jsme zjistili, že nedostatek dusíku způsobil pokles množství fekosterolu a episterolu v lipidových tělískách obou druhů kvasinek, a měl za následek také zvýšenou syntézu mastných kyselin a triacylglycerolů u S. cerevisiae. V Ramanových spektrech vakuol byl identifikován polyfosfát jako vakuolární marker. Zatímco u S. cerevisiae se jeho množství po hladovění nijak dramaticky nezvýšilo, u C. albicans vzrostlo množství polyfosfátu dvojnásobně.
Naše výsledky ukazují, že S. cerevisiae a C. albicans využívají rozdílné strategie pro přežití v případě nedostatku dusíku.
|
39
|
Bc.
Anna
Pershina
|
M2
|
Doc. Ing. Petra Lovecká, Ph.D.
|
Mikrobiální produkce polyhydroxyalkanoátů
|
detail
Mikrobiální produkce polyhydroxyalkanoátů
Polyhydroxyalkanoáty jsou netoxické, biokompatibilní, biologicky odbouratelné termoplasty, které mohou být vyrobeny z obnovitelných zdrojů. Vysoký stupeň polymerace, optická aktivita a nerozpustnost ve vodě dělají PHA vysoce konkurenceschopné vůči polypropylenu či jiným plastům. Existuje však překážka pro velkoobjemovou produkci PHA, a to je jejich výrobní cena, která se v prvé řadě odvíjí od použitého zdroje uhlíku při kultivaci produkčních bakterií. Proto je snaha poměrně drahé substráty nahradit levnými odpadními materiály nebo vedlejšími produkty zemědělské a potravinářské výroby, které by zvýšily konkurenceschopnost PHA. Cílem této práce byl screening PHA - produkčních schopností bakteriálních izolátů v závislosti na čase. Bakteriální izoláty byly kultivovány v LB (24 hod, 28 °C) a E2 médiu (3 a 7 dní, 28 °C). Dále byla sledována produkce PHA u tří izolátů v průběhu 5 dní při kultivaci na LB médiu při 28 °C. Identifikace 10 izolátů byla provedena pomocí MALDI-TOF MS.
|
40
|
Bc.
Lukáš
Plašil
|
M2
|
Ing. Ludmila Karamonová, Ph.D.
|
Imunopurifikace membránových proteinů Cronobacter spp. a jejich následná identifikace pomocí hmotnostní spektrometrie
|
detail
Imunopurifikace membránových proteinů Cronobacter spp. a jejich následná identifikace pomocí hmotnostní spektrometrie
Bakterie rodu Cronobacter jsou podmíněnými patogeny způsobujícími závažná onemocnění u imunokompromitovaných jedinců. Navzdory těžkým průběhům těchto onemocnění není dosud přesně popsaná jejich patogeneze. Navíc se jednotlivé druhy liší svou virulencí, přičemž onemocnění způsobuje nejčastěji C. sakazakii. Tato práce porovnává zastoupení imunogenních membránových proteinů u patogenního kmene C. sakazakii Cb 35 a u zástupců ostatních druhů s následným zaměřením na virulentní proteiny. Membránové proteiny byly rozdělené do frakcí vnější membrány, periplasmy a vnitřní membrány pomocí série ultracentrifugací. Následně byly z frakcí odděleny imunogenní proteiny použitím magnetických částic s navázanými polyklonálními protilátkami. Pro analýzu proteinů byla použita hmotnostní spektrometrie. Identifikovány byly desítky proteinů u jednotlivých kmenů v rámci každé frakce. U všech těchto proteinů bylo určeno pravděpodobné umístění v buňce. Následně bylo podle dostupné literatury vybráno jedenáct potenciálně virulentních membránových proteinů, které by mohly přispívat k virulenci bakterií rodu Cronobacter.
|
41
|
Bc.
Terezie
Páníková
|
M2
|
Ing. Michaela Marková, Ph.D.
|
Charakterizace MbsTA – nového toxin-antitoxin systému z Mycobacterium tuberculosis
|
detail
Charakterizace MbsTA – nového toxin-antitoxin systému z Mycobacterium tuberculosis
Tuberkulóza je mezi deseti nejčastějšími příčinami úmrtí na světě. I když existují různá antibiotika proti tuberkulóze, stále častěji se objevují nové kmeny, které jsou multirezistentní. Proto je třeba nalézt nové cíle antibiotik. Jedním z možných cílů se ukazují Toxin-antitoxin (TA) systémy. Antitoxin, je nestabilní molekula, která tvoří komplex s toxinem a inhibuje ho. Při změně podmínek se komplex rozdělí a uvolní se samotný toxin, který bakterii zabije. MbsTA (mycobacterial suicide Toxin-Antitioxin) byl vybrán jako vhodný cíl pro návrh nových antibiotik, protože není sekretován z buňky a MbsT je pro tuto bakterii silně toxický. Tato práce se zabývá stabilitou MbsTA komplexu, produkcí volného MbsT a určení jeho katalytické aktivity in vitro pomocí fluorescenčního stanovení NAD(P)+.
|
42
|
Bc.
Sandra
Pšeničková
|
M2
|
Ing. Petr Kaštánek, Ph.D.
|
Antimikrobiální účinky extrahovaných látek z mikrořas a sinic
|
detail
Antimikrobiální účinky extrahovaných látek z mikrořas a sinic
Mikrořasy mohou být zdrojem pigmentů, polynenasycených mastných kyselin, polysacharidů, vitamínů, antioxidantů a antimikrobiálních látek, a proto je jejich biomasa využívána v potravinářství, kosmetice a nově také v medicíně.
Cílem této práce bylo sledovat antimikrobiální aktivitu vodných, ethanolových a propylenglykolových extraktů mikrořas proti vybraným patogenním bakteriím.
Pro testování antimikrobiálních účinků extraktů látek z mikrořas byla použita difúzní metoda, podle které byly vybrány extrakty s vyšší inhibiční aktivitou. Pro další testování byly vytvořeny extrakty z vybraných mikrořas ve větším množství. U takto vytvořených extraktů byla sledována antimikrobiální aktivita v různých koncentracích extraktů mikrořas.
Na základě počátečního testování byly vybrány ethanolové extrakty látek získaných z mikrořas Chlorella vulgaris, Arthrospira maxima, Scenedesmus sp. a Trachydiscus minutus.
|
43
|
Bc.
Eliška
Semrádová
|
M2
|
doc. RNDr. Jarmila Pazlarová, CSc.
|
Metody detekce polysacharidů v matrici biofilmů Listeria monocytogenes
|
detail
Metody detekce polysacharidů v matrici biofilmů Listeria monocytogenes
Listerióza je alimentární onemocnění způsobené grampozitivní bakterií Listeria monocytogenes. Největším rizikem nákazy je konzumace potravin, jako jsou zrající sýry, saláty, syrové maso nebo nepasterizované mléko. Listerie se do potravin často dostává již ve výrobě z povrchů výrobních zařízení, které pokrývá vrstvou biofilmu. Tento biofilm je prakticky neviditelný a velice odolný vůči stresovým podmínkám, jako je chlad, nízké pH, vysoká koncentrace solí nebo působení dezinfekčních prostředků. Součástí biofilmu jsou kromě nukleových kyselin a proteinů také exopolysacharidy. Cílem této práce je z matrice biofilmu vhodnými metodami porovnat složky polysacharidů u jednotlivých kmenů L. monocytogenes a zjistit, jakým způsobem ovlivňují okolní podmínky jejich produkci.
|
44
|
Bc.
Tatiana
Smirnova
|
M2
|
doc. Dr. Ing. Hynek Radovan
|
Zkoumání vlivu abiotických stresů na odpověď plodin s využitím kvantitativní proteomiky
|
detail
Zkoumání vlivu abiotických stresů na odpověď plodin s využitím kvantitativní proteomiky
Během života jsou rostliny vystaveny různým abiotickým stresům, nejčastěji to bývají nízké a vysoké teploty, osmotický stres, oxidační stres, salinita atd. Během abiotického stresu může docházet k denaturaci proteinů a značnému poškození membrán buněk pletiv rostliny. Ke zvýšení produktivity plodin za nepříznivých podmínek a k rozvoji šlechtění rostlin lze použít ochranné proteiny (např. dehydriny; DHN) jako diagnostické markery působení stresu. Jedná se o proteiny, které patří ke skupině LEA II (late embryogenesis abundant) proteinů, které se akumulují v pozdním stádiu embryogeneze.
Kombinaci dvou metod (Western blotu a 2D-DIGE) lze prokázat přítomnost DHN a kvantitativně vyhodnotit jejich obsah v pletivech zkoumaných rostlin. V daném experimentu se ověřoval vliv nízkých teplot nad bodem mrazu na vzorky ozimého ječmene odrůd Cenader a Luxor a vliv sucha na vzorky melounů odrůd Creamson sweet a Sugar baby. Zatím v průběhu experimentů bylo prokázáno, že podstatně více DHN u ječmene lze nalézt u rostlin, které byly vystaveny nízkým teplotám, než u těch, které se pěstovaly za běžných podmínek. V případě melounů nelze přesně stanovit závislost mezi hladinou DHN v kontrolách a po působení abiotického stresu.
|
45
|
Bc.
Lucie
Staňková
|
M1
|
Ing. Jitka Viktorová, Ph.D.
|
Zavedení metod pro vyhodnocení vlivu abiotického stresu na transgenní rostliny ječmene
|
detail
Zavedení metod pro vyhodnocení vlivu abiotického stresu na transgenní rostliny ječmene
Cílem této práce bylo zavést metody pro vyhodnocení vlivu abiotického stresu na transgenní rostliny ječmene (Hordeum vulgare L.) a zejména jejich optimalizace pro robotické zpracování vzorků, která povede ke standardizovanému hodnocení transgenních rostlin. Konkrétně se pracovalo s rostlinami obsahující transgen osmotinu, což je protein, který hraje významnou roli v odolnosti rostlin vůči patogenům a abiotickému stresu.
Metody byly zaměřené na optimalizaci a studium biochemických (obsah chlorofylu, proteinů a malondialdehydu) a antioxidačních (enzymová aktivita glutathion reduktasy a askorbát peroxidasy) charakteristik. Mladé rostliny ječmene byly vystaveny abiotickému stresu způsobeného zasolením, kdy byly po čtyři týdny zalévané roztokem soli o koncentraci 0 mM, 150 mM, 300 mM a 450 mM, a stresu suchem, při čemž část rostlin nebyla po dobu čtrnácti dní zalévaná.
|
46
|
Bc.
Zuzana
Stehlíková
|
M2
|
doc. Ing. Lenka Burketová, CSc.
|
Tvorba kořenových vlásků rostliny Arabidopsis thaliana v interakci s bakterií Pseudomonas syringae
|
detail
Tvorba kořenových vlásků rostliny Arabidopsis thaliana v interakci s bakterií Pseudomonas syringae
V odpovědi na různé environmentální stresy zintenzivňují rostliny růst kořenových vlásků. Velmi dobře popsán je pozitvní efekt na kořenové vlásky při styku rostliny s rhizobakteriemi, které podporují růst rostlin. Doposud ovšem nebyl testován vliv patogenních bakterií na růst kořenových vlásků.
V naší práci jsme použili modelový patosystém Arabidopsis thaliana x Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 (P. syringae). Rostliny A. thaliana kultivované za sterilních podmínek jsme ošetřili suspensí obsahující P. syringae. Takto ošetřené rostliny vykazují stimulaci růstu kořenových vlásků. Zjistili jsme, že ošetření dalšími bakteriemi, jako jsou E.coli a A. tumefaciens vyvolává též stimulaci růstu kořenových vlásků. Rostliny na napadení patogeny reagují aktivací svého sofistikovaného imunitního systému, jehož významnou součástí jsou signální dráhy fytohormonů kyselin salicylové, jasmonové a etylénu. Zajímala nás role těchto drah při stimulaci kořenového vlášení. Ukázalo se, že dominantní roli v regulaci růstu kořenových vlásků má ethylen. Naše data ukazují, že nejen bakterie podporující růst mohou stimulovat kořenové vlášení, ale že se jedná o obecný fenomén spuštěný při interakci rostlin s bakteriemi.
|
47
|
Bc.
Anna
Stellnerová
|
M2
|
Ing. Ludmila Karamonová, Ph.D.
|
Sestavení a charakterizace multianalytového imunotestu pro klasické stafylokokové enterotoxiny
|
detail
Sestavení a charakterizace multianalytového imunotestu pro klasické stafylokokové enterotoxiny
Stafylokokové enterotoxiny jsou proteiny produkované bakteriálním patogenem Staphylococcus aureus, který je běžným kolonizátorem kůže a sliznic. Ačkoliv je lidský organismus vůči stafylokokové infekci odolný, při oslabení imunity může způsobit různě závažná onemocnění. Kontaminace potravin stafylokokovými enterotoxiny ovlivňuje jejich zdravotní nezávadnost, a proto je nutné vyvíjet rychlé metody pro jejich detekci.
Dosud byly pro jednotlivé klasické stafylokokové enterotoxiny vyvinuty imunochromatografické testy (ICT) za nejvýhodnějších podmínek pro každý z nich. Cílem této práce bylo sjednocení podmínek a vývoj jednotného multianalytového testu. Nejdříve bylo nutné ověřit funkčnost a detekční limity jednotlivých ICT v otevřeném formátu. V průběhu práce byl sestaven a charakterizován multitest, který byl následně převeden do uzavřeného formátu. Dále budou vybrány vhodné podmínky pro uzavřený formát a test bude ověřen na vzorcích mléčných produktů. Vyvíjený multianalytový test by měl mít schopnost detekovat testované analyty v hodnotách ng.ml-1, a měl by být vhodný pro využití přímo v terénu.
|
48
|
Bc.
Veronika
Sucháňová
|
M2
|
Ing. Jaroslav Zelenka, Ph.D.
|
Antimikrobiálna fotodynamická terapia pomocou organokovových zlúčenín a materiálov
|
detail
Antimikrobiálna fotodynamická terapia pomocou organokovových zlúčenín a materiálov
Fotodynamická terapia (PDT) je metóda liečby nádorových ochorení a povrchových infekcií. Spôsobuje poškodenie cieľových buniek na základe interakcie inak neškodného fotosenzibilizátora a viditeľného svetla. Fotosenzibilizátor je chemická látka, ktorá reaguje na expozíciu svetlom vznikom singletového kyslíka a voľných kyslíkových radikálov. V tejto práci boli skúmané antimikrobiálne vlastnosti molybdénového klastru KK671 a vrstiev oxidu titaničitého (TiO2) proti baktériám Pseudomonas aeruginosa a Enterococcus faecalis. Boli uskutočnené dva typy experimentov. Látka KK671 bola pridaná do bakteriálnej suspenzie, ktorá bola následne osvietená modrým svetlom. V druhom type experimentov bol najprv na vrstve TiO2 kultivovaný bakteriálny biofilm, ktorý bol na druhý deň osvietený halogénovým svetlom. V oboch prípadoch bol zaznamenaný dramatický úbytok bakteriálnej populácie v porovnaní s kontrolou. Výsledky naznačujú, že fotosenzitívne látky by mohli mať antimikrobiálne vlastnosti a môžu byť využité na liečbu kožných ochorení a sterilizáciu medicínskych a priemyselných zariadení.
|
49
|
Bc.
Jakub
Sýs
|
M2
|
Ing. Petra Junková, Ph.D.
|
Interakce mezi matrixovým proteinem a cytoplasmatickou doménou polyproteinu Env Mason-Pfizerova opičího viru
|
detail
Interakce mezi matrixovým proteinem a cytoplasmatickou doménou polyproteinu Env Mason-Pfizerova opičího viru
Mechanismus transportu a uvolňování nových virových částic spočívá u viru lidské imunodeficience (HIV) v interakci matrixového proteinu (MA) s cytoplazmatickou doménou polyproteinu Env (CT). U Mason-Pfizerova opičího viru (M-PMV), který se ve zmíněných mechanismech od HIV odlišuje, nebyla daná interakce dosud prokázána. Dosavadní studie však naznačují, že i u M-PMV může tato interakce hrát roli ve virovém transportu uvnitř hostitelské buňky.
V rámci naší studie byla využita metoda in vitro proteinového prokřižování s následnou hmotnostně-spektrometrickou analýzou, která umožňuje detekci a identifikaci prokřížených peptidů. Detekce prokřížených peptidů pocházejících současně z MA a CT by tak nejen potvrdila interakci těchto dvou proteinů, ale též přispěla k odhalení oblastí, které jsou za interakci zodpovědné.
Na základě získaných dat byla prokázána přítomnost obou proteinů v jednotlivých analyzovaných zónách. Pomocí softwaru StavroX však nebyly nalezeny žádné relevantní signály prokřížených peptidů. Z dosavadních výsledků tedy není možné usuzovat, zda k dané interakci opravdu dochází. V budoucnu bude proto studována interakce také mezi dalšími formami zmíněných proteinů či budou využity jiné softwary pro spolehlivé vyhodnocení dat.
|
50
|
Bc.
Barbora
Teplá
|
M2
|
doc. Ing. Pavel Ulbrich, Ph.D.
|
Význam signální dráhy ERK v dlaždicových karcinomech hlavy a krku
|
detail
Význam signální dráhy ERK v dlaždicových karcinomech hlavy a krku
Nádory postihující epiteliální tkáň hlavy a krku (HNSCC) jsou 6. nejčastějším typem rakoviny na světě s každoročním nárůstem o 650 000 nových případů a s více než 50% mortalitou. Nepříznivým faktorem je i to, že se jedná o heterogenní skupinu nádorů, která se liší patogenezí, lokalizací, biologií a léčbou. Mezi hlavní rizikové faktory patří kouření, alkohol a HPV infekce. HPV status je významným prognostickým faktorem, díky němuž lze onemocnění rozdělit na dvě skupiny. Skupina HPV pozitivních nádorů, která je charakteristická pro mladší sexuálně aktivní ženy, má výrazně lepší prognózu, zatímco HPV negativní nádory jsou typické pro muže nad 60 let, kteří kombinují kouření a pití alkoholu a mají obecně horší prognózu. Pro zlepšení prognostických postupů a navržení nových typů léčby je nutné identifikovat nové cíle, které podmiňují vznik tohoto onemocnění, Tato práce má za cíl popsat možný vliv signální dráhy ERK, zvláště pak proteinkináz ERK1 a ERK2, na vznik a vývoj HNSCC. Analýzou expresních profilů bylo zjištěno, že 80 % nádorů má sníženou hladinu proteinkinázy ERK1, ale ne ERK2, což naznačuje, že by proteinkináza ERK1 mohla mít tumor-supresorovou funkci. Pro ověření této hypotézy jsou prováděny expresní profily ve vzorcích nádorové tkáně a buněčných linií odvozených od HNSCC.
|
51
|
Bc.
Veronika
Todorovová
|
M2
|
doc. Ing. Pavel Ulbrich, Ph.D.
|
Efekt vybraných mutací kapsidového proteinu M-PMV na jeho životní cyklus
|
detail
Efekt vybraných mutací kapsidového proteinu M-PMV na jeho životní cyklus
Předpokladem pro vývoj nových inhibitorů skládání retrovirové částice je detailní znalost její struktury, díky níž mohou být vytipovány aminokyseliny důležité pro protein-proteinové interakce v rámci částice. Tyto interakce jsou zprostředkované především aminokyselinami v kapsidovém proteinu viru (CA), který je tvořen dvěma doménami, N-terminální doménou (NTD) a C-terminální doménou (CTD). Na základě struktury NTD CA proteinu Mason-Pfizerova opičího viru (M-PMV) byly určeny aminokyseliny, které by se na proteinových interakcích v částici měly podílet. Nejprve byly připraveny DNA konstrukty kódující proteiny nesoucí mutace vybraných aminokyselin NTD CA pro přípravu strukturních proteinů v bakteriálních buňkách a pro následné studium tvorby částic z těchto proteinů in vitro. Poté byly připraveny odpovídající DNA konstrukty kódující celovirový genom, které byly využity pro transfekci vhodných buněk tkáňových kultur pro sledování vlivu mutací na životní cyklus viru. Zjistili jsme, že některé z mutací vybraných aminokyselin CA proteinu ovlivňují morfologii částic M-PMV a infektivitu tohoto viru a jsou tedy velmi významné pro jeho životní cyklus.
|
52
|
Bc.
Nikola
Vrzáčková
|
M2
|
Ing. Jaroslav Zelenka, Ph.D.
|
Metabolismus glutaminu a odpověď na stres v nádorovém prostředí
|
detail
Metabolismus glutaminu a odpověď na stres v nádorovém prostředí
Nádorová onemocnění představují druhou nejčastější příčinu úmrtí ve světě. Při transformaci nenádorové buňky na buňku nádorovou dochází k podstatné změně v buněčném metabolismu. Hlavní úlohu v tomto „boji o přežití“ hrají zásoby nutrientů, v čele se dvěma nejdůležitějšími energetickými a stavebními zdroji, glukosou a glutaminem. Tato práce se zaměřuje na druhý z těchto metabolitů, glutamin, na jehož roli v nádorové buňce nespecificky cílí léčivo, běžně používané pro léčbu akutní lymfoblastické leukémie, asparaginasa. Na lidských nádorových liniích adenokarcinomu pankreatu PaTu, karcinomu děložního čípku HeLa a kontrolní nenádorové linii fibroblastů HDF byl studován vliv glutaminu, konkrétně jeho akutní a chronické deplece. Po čtyřdenní kultivaci buněk a následném vystavení zvýšenému oxidačnímu stresu aplikací peroxidu vodíku byla s využitím resazurinu měřena viabilita buněk. Z naměřených dat vyplývá, že již akutní deplece glutaminu zásadním způsobem snižuje odolnost buněk vůči oxidačnímu stresu. Této skutečnosti by mohlo být využito při terapii chemo/radioresistentních solidních tumorů.
|
53
|
Bc.
Anna
Zmeškalová
|
M2
|
prof. Ing. Martin Fusek, CSc.
|
Nové lipidizované analogy anorexigenního peptidu uvolňujícího prolaktin
|
detail
Nové lipidizované analogy anorexigenního peptidu uvolňujícího prolaktin
Obezita je častou metabolickou poruchou, ovlivňující několik dalších životně nebezpečných nemocí, včetně diabetes mellitus typu 2, hypertenze a aterosklerózy. Několik studií také ukazuje, že pacienti s diabetem mají o 50 - 75 % zvýšenou pravděpodobnost výskytu Alzheimerovy choroby a naopak. Jelikož se výskyt obezity stále zvyšuje, bylo by užitečné najít účinnou neinvazivní terapii. Zajímavou metodou pro léčbu obezity by mohly být centrálně uvolňované a působící anorexigenní neuropeptidy, nicméně jejich dodání z periferie do mozku je komplikované, jelikož tyto peptidy mají nízkou stabilitu a limitovaný prostup skrze hemato-encefalitickou bariéru a není je proto možné podávat periferně. Jednou z modifikací, která může vést k lepší prostupnosti přes hemato-encefalickou bariéru, je lipidizace peptidů. Cílem této práce je farmakologická charakterizace
nových stabilních lipidizovaných analogů anorexigenního peptidu uvolňujícího prolaktin (PrRP) a to jak z hlediska vazby na receptor a signalizace v in vitro testech na buňkách s receptorem GPR10 a na neurálních buňkách SY5Y, tak z hlediska příjmu potravy u myší v in vivo testech. Zároveň probíhá měření apoptotických účinků u buněk SY5Y po působení methylglyoxalu a vliv analogů PrRP na apoptozu, případně jejich neuroprotektivní účinky.
|
54
|
Bc.
Andrea
Zubrová
|
M2
|
Ing. Jáchym Šuman, Ph.D.
|
Příprava biosenzorového kmene pro stanovení indukce genu bphA sekundárními metabolity rostlin
|
detail
Příprava biosenzorového kmene pro stanovení indukce genu bphA sekundárními metabolity rostlin
Od roku 1966, kdy byly polychlorované bifenyly (PCB) poprvé popsány jako globálně rozšířené polutanty životního prostředí, jsou intenzivně studovány možnosti jejich odstranění. Bakteriální gen bphA kóduje první a klíčový enzym kometabolické degradace PCB bifenyl-2,3-dioxygenasu, zodpovědnou za aktivaci jinak persistentního aromatického kruhu. PCB vykazují strukturní analogii se sekundárními metabolity rostlin (SMR), jež jsou přirozenou součástí rhizosféry. Několik studií již poukázalo na to, že některé SMR mohou významně zvyšovat indukci genú bph v půdních bakteriích. Tato práce se zabývá konstrukcí biosenzorového kmene půdní bakterie Pseudomonas alcaliphila JAB1, umožňující určení míry indukce genu bphA látkami z řady SMR a napomoci tak objasnění interakcí v systému půdní bakterie-rostliny.
Biosenzorový kmen JAB1 je připravován dvěma způsoby. První byl proveden zařazením reportérového genu egfp do chromozomu homologní rekombinací pomocí systému λ-Red. V druhém případě byl do bakterie elektroporací vpraven plasmid pro extrachromozomální koexpresi bphA a egfp. Takto připravené biosenzorové kmeny budou následně exponovány SMR a míra indukce genu bphA těmito sloučeninami bude určena fluorimetricky.
|
55
|
Bc.
Petra
Zídková
|
M2
|
Ing. Sabina Purkrtová, Ph.D.
|
Detekce a charakterizace vybraných Bacillus spp. včetně toxinogenních B. cereus v potravinách
|
detail
Detekce a charakterizace vybraných Bacillus spp. včetně toxinogenních B. cereus v potravinách
Rod Bacillus patří mezi nejrozmanitější bakteriální rody. Vzhledem ke své schopnosti sporulace a široké enzymové výbavě je ubikvitně rozšířen a patří proto i mezi časté mikrobiální kontaminanty potravin. Mezi často izolované druhy způsobující kažení potravin patří B. subtilis, B. licheniformis a B. pumilus, zatímco B. cereus je původcem emetického či diarhogenního syndromu vzhledem ke své schopnost produkovat enterotoxiny v potravině (emetický toxin) či v tenkém střevě (hemolytický toxin HBL, nehemolytický toxin NHE). Cílem naší práci je proto zavést protokoly pro spolehlivou detekci, identifikaci a charakterizaci výše uvedených Bacillus spp. včetně genů pro enterotoxiny B. cereus metodami PCR a MALDI-TOF MS a tyto protokoly dále použít pro studium jejich výskytu v potravinách.Bylo použito 20 sbírkových kmenů a 9 izolátů z potravin. Při identifikaci metodou MALDI-TOF MS poskytla nejlepší výsledky metoda extrakce, kdy bylo dosaženo spolehlivé druhové identifikace pro skupinu B. cereus a B. subtilis a bezpečné rodové identifikace pro B. pumilus a B. licheniformis. Byly zavedeny a ověřeny druhově (B. cereus a B.licheniformis) a rodově specifické PCR protokoly a protokoly pro enterotoxiny HBL a NHE, jejichž přítomnost se prokázala u 66 %, resp. 100 % z 12 testovaných kmenů B. cereus.
|
56
|
Bc.
Charlotte
Čuhajová
|
M2
|
Ing. Jiří Suttnar, CSc.
|
Cílená metabolomika plasmy pacientů s hematologickými malignitami
|
detail
Cílená metabolomika plasmy pacientů s hematologickými malignitami
Tato práce se zabývá, jak zhoubným onemocněním, tak leukemií. Při zhoubných onemocněních včetně leukemií mění rakovinné buňky svůj metabolismus tak, aby podporoval růst, přežívání a proliferaci. Společným znakem pozměněného metabolismu je zvýšená spotřeba glukózy, její přeměna na laktát a snížená oxidační fosforylace i za přítomnosti plně funkčních mitochondrií. Tento efekt se nazývá aerobní glykolýza (Warburgův efekt). Savčí buňky katabolizují hlavně glukózu a glutamin, a proto jsou s nimi související metabolity sledovány i při onkohematologických onemocněních. Změněný metabolizmus doprovází rovněž oxidační stres, který je často charakterizován plazmatickou koncentrací malondialdehydu (MDA). Pro sledování metabolitů citrátového cyklu a volných aminokyselin v plazmě jsme použili kapalinovou chromatografii s hybridním hmotnostním spektrometrem QTRAP 4000 (Amedis, Praha). Pro oba typy metabolitů byly testovány různé kolony. Pro metabolity citrátového cyklu se zatím nejvíce osvědčila kolona Xbridge Amide (Waters, Praha), pro aminokyseliny to byla kolona Zic-Hilic (Merck, Praha). Pomocí uvedených metod budou stanoveny koncentrace metabolitů citrátového cyklu, aminokyseliny a MDA v plazmě pacientů s onkohematologickými malignitami a v plazmě kontrolní skupiny zdravých dárců.
|
57
|
Bc.
Bára
Čížková
|
M2
|
Ing. Tomáš Podzimek, Ph.D.
|
Hledání nespecifických nukleas v křenu selském (Armoracia rusticana)
|
detail
Hledání nespecifických nukleas v křenu selském (Armoracia rusticana)
Nukleasy jsou enzymy ze třídy hydrolas, které hydrolyticky štěpí fosfodiesterovou vazbu nukleových kyselin. Díky těmto vlastnostem byly u nukleas z různých druhů rostlin testovány a u některých i potvrzeny protinádorové účinky. Cílem této práce je najít a zjistit sekvenci genu kódujícího nukleasu v kořeni křenu selského (Armoracia rusticana), jakožto rostlině využívající se nejen v české tradiční medicíně. Pro získání sekvence genu kódujícího nukleasu byla nejprve využita metoda 3' RACE (Rapid Amplification of cDNA ends), která je založená na využití polyA sekvence na 3' konci mRNA, na kterou nasedá primer oligodT, a druhého genově specifického primeru. Využití této metody vedlo ke vzniku velkého množství produktů, proto byly následně navrženy genově specifické primery na konzervované sekvence, které byly objeveny při porovnání deseti nukleotidových sekvencí nukleas z rostlin z čeledi brukvovitých. Tyto nově navržené primery budou použity k amplifikaci části sekvence genu kódujícího zatím neznámou nukleasu.
|
58
|
Monika
Čížková
|
B3
|
Ing. Michaela Marková, Ph.D.
|
Produkce a charakterizace rekombinantního proteinu RnhD z Mycobacterium smegmatis
|
detail
Produkce a charakterizace rekombinantního proteinu RnhD z Mycobacterium smegmatis
Mycobacterium tuberculosis (MTB) způsobuje onemocnění tuberkulózu, na kterou ročně zemře více než 1 500 000 lidí. Přestože nemoc je antibiotiky léčitelná, léčba nebývá vždy účinná. Jedna z příčin neúčinné terapie je i schopnost mikroorganismu přežívat v extrémních podmínkách za hypoxie a vysokého oxidačního stresu v dormatním stavu. Do toho se stavu se mykobakterie může dostat díky útlumu metabolismu, který je součástí tzv. stringentní odpovědi. Tato stresová odpověď je řízena signální molekulou (p)ppGpp zvanou alarmon. Předpokládá se, že na regulaci alarmonu se podílí i protein RnhD, která navíc disponuje nukleázovou aktivitou. Znalost mechanismu působení tohoto proteinu by mohl poskytnout nové cesty léčby tuberkulózy. Ke studiu této dráhy využíváme modelový nepatogenní organismus Mycobacterium smegmatis, ze kterého byl izolován gen pro RnhD. Cílem bylo vložit tento gen do vektoru pTriex.Ti vhodného pro produkci cílového proteinu v E.coli, vyizolovat a přečistit exprimovaný protein a ověřit jeho katalytické vlastnosti.
|
59
|
Bc.
Hana
Řezáčková
|
M2
|
Ing. Jiří Šantrůček, Ph.D.
|
Sledování změn proteomu lidských kmenových buněk v průběhu osteodiferenciace
|
detail
Sledování změn proteomu lidských kmenových buněk v průběhu osteodiferenciace
Titanové materiály jsou nejpoužívanějším biomateriálem pro kloubní náhrady. V současné době je vyvíjeno velké úsilí používané materiály modifikovat tak, aby byly zlepšeny jejich mechanické vlastnosti i interakce s tkáněmi. Sledování změn proteomu kmenových buněk v průběhu kultivace v médiu s osteodiferenciačními faktory by mohlo sloužit ke zjištění potenciálních biomarkerů, které by se daly využít k pozorování reakce buněk při růstu na nových biomateriálech. Tato práce se zabývá sledováním změn v proteomu buněk hTERT, imortalizovaných lidských kmenových buněk odvozených od tukové tkáně, v průběhu růstu v kontrolním médiu a médiu obsahujícím osteodiferenciační faktory. Po 7, 14 a 21 dnech růstu byly buňky lysovány, izolované proteiny rozštěpeny trypsinem a zastoupení jednotlivých proteinů určeno pomocí label-free kvantifikace ve spojení s kapalinovou chromatografií a hmotnostní spektrometrií. Naměřená data byla podrobena statistickému a bioinformatickému vyhodnocení. Bylo zjištěno, že nejvýznamnější změny v hladinách proteinů oproti kontrolnímu médiu nastaly u buněk po 14 dnech kultivace, přičemž mezi nejvíce zasažené procesy patřily metabolismus kolagenu a organizace extracelulární matrix.
|
60
|
Bc.
Soňa
Šimková
|
M2
|
Ing. Jan Lipov, Ph.D.
|
Mechanismus vazby a působení nových syntetických drog a jejich prekursorů na dopaminové receptory
|
detail
Mechanismus vazby a působení nových syntetických drog a jejich prekursorů na dopaminové receptory
V posledných rokoch sa na trhu objavuje čím ďalej tým viac nových syntetických drog. Dôvodom je snaha vyrobiť psychoaktívne látky, ktoré by boli legálne. Tieto látky sa často vyrábajú z už existujúcich liečiv či drog pozmenením ich štruktúry, čím sa stávajú legislatívou nepostihnuteľné. S rastúcim počtom prípadov ich zneužitia preto rastie aj dopyt po efektívnej metóde ich štúdia. Keďže syntetické drogy a ich prekurzory účinkujú prostredníctvom interakcie s receptormi spojenými s G-proteínom, cieľom tejto práce je zistiť, na ktoré receptory konkrétne tieto látky pôsobia. Práve za týmto účelom sme vytvorili bunkovú líniu produkujúcu dopamínové receptory D1 a D2 použitím reportérového systému TANGO. Pretože tento systém funguje na princípe aktivácie prepisu reportérového génu pre luciferázu vždy pri naviazaní látky na receptor, sme schopní jednoznačne určiť interakciu medzi neznámou látkou a dopamínovým receptorom. S použitím navrhnutého systému bude možné dosiahnuť náš hlavný cieľ, ktorým je otestovanie knižnice látok s neznámym cieľovým receptorom.
|
61
|
Bc.
Kristýna
Šimáčková
|
M2
|
Ing. Hana Michova, Ph.D.
|
Vliv externích faktorů na přežívání Campylobacter jejuni v životním prostředí
|
detail
Vliv externích faktorů na přežívání Campylobacter jejuni v životním prostředí
Campylobacter jejuni je gramnegativní patogenní bakterie. Ze špatně tepelně upravených potravin, se dostává do zažívacího traktu, kde způsobuje záněty vedoucí ke gastroenteritidě, která je nejčastějším alimentárním onemocnění v EU.
Četnost výskytu kampylobakterióz je v rozporu s citlivostí této mikroaerobní bakterie k vnějším podmínkám. C. jejuni se v potravinách nemnoží, v laboratoři je těžce kultivovatelný, a přesto jsou tyto bakterie poměrně často izolovány z různých vodních zdrojů. Cílem této práce je charakterizovat schopnost C. jejuni přežívat ve vodním prostředí za různých podmínek. Pro tento účel bude jako základ použita tradiční kultivační metoda počítání kolonií, kdy je sledován úbytek počtu kolonie tvořících jednotek v čase. Čím je tento úbytek rychlejší, tím je bakterie na dané podmínky náchylnější. Sledovány budou dva externí faktory: teplota (4, 25, 30, 37 °C) a složení vodního prostředí (destilovaná voda, fyziologický roztok, voda z řeky/rybníka, BHI), a to u tří sbírkových kmenů C. jejuni. Naměřená data budou ověřena pomocí průtokové cytometrie spojené s vitálním barvením bakterií. Předpoklad je takový, že voda z přírodního zdroje bude ve spojení s nižší teplotou podporovat přežití C. jejuni kvůli snížené metabolické aktivitě a přítomnosti ochranných látek.
|
62
|
Bc.
Anna
Šišková
|
M2
|
Ing. Hana Michova, Ph.D.
|
Vliv navržených experimentálních podmínek na výsledky kvantifikace biofilmu
|
detail
Vliv navržených experimentálních podmínek na výsledky kvantifikace biofilmu
Biofilmy jsou mikrobiální společenství obklopující se matricí složenou převážně z exopolysacharidů, lipidů, bílkovin a extracelulární DNA. Biofilm je zpravidla přichycen k pevnému podkladu biotického či abiotického charakteru.
Existuje celá řada metod pro kvantifikaci biofilmů, avšak nejpoužívanější je semikvantitativní metoda barvení biofilmu krystalovou violetí. V současné době se postup této metody mezi jednotlivými laboratořemi značně liší, čímž není možné výsledky jednotlivých měření porovnávat a vyhodnocovat. Hlavním cílem práce bylo proměřit a statisticky vyhodnotit 256 kombinací 4 nejčastěji používaných parametrů metody barvení biofilmu krystalovou violetí, aby se zjistilo, která kombinace poskytuje konstantní a reprodukovatelné výsledky. Jako modelový organismus byl použit kmen Staphylococcus aureus. Data naměřená pomocí barvení krystalovou violetí budou dále porovnána s hodnotami získanými z obrazové analýzy dat naměřených konfokálním mikroskopem s rotujícím diskem. Výsledkem této diplomové práce by měl být návrh standardizovaného protokolu metody barvení biofilmu krystalovou violetí. Rozšíření tohoto protokolu mezi laboratoře by umožnilo sběr a hlubší analýzu velkého množství dat, která by mohla dále objasnit mechanismy tvorby biofilmu jednotlivých mikroorganismů.
|
63
|
Bc.
Tereza
Šmrhová
|
M2
|
Ing. Michal Strejček, Ph.D.
|
Vliv sekundárních metabolitů rostlin Helianthus annuus L. na strukturu bakteriálních společenstev v zemině
|
detail
Vliv sekundárních metabolitů rostlin Helianthus annuus L. na strukturu bakteriálních společenstev v zemině
Slunečnice roční (Helianthus annuus L.) není jen zemědělskou rostlinou, ale je také často využívána v bioremediačních procesech. Zde se uplatňuje obzvlášť bohatost jejich sekundárních metabolitů, které se liší napříč různými kultivary. Právě přítomnost sekundárních metabolitů v okolí kořenů významně ovlivňuje bakteriální aktivitu a diverzitu v rhizosféře. Navýšení bakteriální aktivity může vyvolat žádoucí efekt odstranění xenogenních látek, které jsou strukturně podobné produkovaným rostlinným metabolitům.
Cílem této práce je pomocí metagenomických nástrojů zmapovat změny ve struktuře bakteriálních společenstev v zemině při simulovaném rozpadu kořenů odlišných kultivarů Slunečnice roční. Vybráno bylo 9 odlišných kultivarů, které byly hydroponicky pěstovány do dosažení stáří 65 dní. Kořeny těchto rostlin byly podrobeny analýze sekundárních metabolitů pomocí hmotnostní spektrometrie. Dle výsledků složení kořenů byla s vybranými kultivary zahájena simulace rozpadu kořenů v laboratorních mikrokosmech se zeminou. Z mikrokosmů bude v průběhu experimentu odebráno několik odběrů v čase 0‑50 dní. Tyto odběry budou podrobeny izolaci totální DNA, amplifikaci genu pro 16S rRNA a charakterizaci pomocí molekulárních metod za účelem dosažení vytčených cílů.
|
64
|
Bc.
Daniela
Španková
|
M2
|
Ing. Holubová Barbora, Ph.D.
|
Vývoj multianalytové ELISA pro detekci vybraných syntetických drog
|
detail
Vývoj multianalytové ELISA pro detekci vybraných syntetických drog
Problémem dnešní doby je nadměrná produkce nových psychoaktivních látek (NPS), která se vymyká legislativní kontrole. NPS jsou syntetické a rostlinné substance s různým účinkem. Informace o toxicitě a účincích jsou nedostatečné a jsou spojené s vysokou úmrtností. Vysoká poptávka po metodách s rychlou a finančně nenáročnou analýzou rozsáhlého množství vzorků není překvapující. Mezi hlavní skupiny patří např. syntetické kanabinoidy, fenetytyaminy a tryptaminy, kterými se tato práce zabývá. Cílem práce je sestavení multiplexní ELISA, tak aby se pomocí jedné analýzy dal otestovat vzorek na širší skupině analytů, a to zejména na základě strukturní variability námi sledovaných syntetických drog. Pro sestavení metody se používá nepřímý kompetitivní formát ELISA na mikrotitrační desce. Prvním krokem práce bylo sestavení titračních křivek (DIPT,2C-B a pravadolin), z kterých proběhl výběr čtyř kombinací protilátek s imobilizačním konjugátem pro jednotlivé drogy. Poté byly sestaveny kalibrační křivky a vhodné podmínky pro jednotlivé imunochemické formáty (koncentrace konjugátu s koncentrací protilátky, složení reakčního pufru). Dále byly protilátky smíchány a použity pro sestavení kalibrační křivky pro multiplexní imunoanalýzu. Metoda byla charakterizována stanovením analytických parametrů.
|
65
|
Bc.
Michal
Špirko
|
M2
|
Ing. Sabina Purkrtová, Ph.D.
|
Genetické determinanty regulace tvorby biofilmu u Salmonella spp.
|
detail
Genetické determinanty regulace tvorby biofilmu u Salmonella spp.
Salmonelóza je druhým nejčastějším gastrointestinálním onemocněním v Evropě. Původcem salmonelózy jsou některé sérotypy bakterií rodu Salmonella z čeledi Enterobacteriaceae. Tyto bakterie jsou schopny nejen na abiotických površích v potravinářské výrobě tvořit biofilm - vícebuněčnou mikrobiální komunitu. Biofilm jim umožňuje dlouhodobě přežívat v nepříznivých podmínkách. Trojrozměrná struktura biofilmu je poté tvořena převážně z exopolysacharidů (celulóza, sacharidové složky O-antigenu) a z proteinů (bičíky, povrchový protein BapA, svazky fimbrií - tzv. curli). Hlavním regulátorem tvorby biofilmu je transkripční aktivátor CsgD, který aktivuje transkripci genů zajišťujících syntézu složek biofilmu.
Cílem naší práce je predikce tvorby biofilmu na základě genetické analýzy. Pomocí PCR amplifikace regulační oblasti a části vnitřní sekvence genu csgD byl jeho výskyt prokázán u všech 55 studovaných kmenů Salmonella spp. Pro dva kmeny Salmonella Typhimurium s odlišnou mírou tvorby biofilmu byly poté srovnány sekvence PCR produktů amplifikace regulační oblasti. U těchto kmenů byl dále stanoven profil tvorby biofilmu v závislosti na teplotě, složení média a obsahu glukózy, sacharózy a laktózy při různých metodách semikvantifikace biofilmu v mikrotitrační destičce krystalovou violetí.
|
66
|
Bc.
Barbora
Štancelová
|
M2
|
Ing. Jan Lipov, Ph.D.
|
Srovnávání metod pro sledování osteodiferenciace buněk hTERT-ASC a SaOS-2
|
detail
Srovnávání metod pro sledování osteodiferenciace buněk hTERT-ASC a SaOS-2
Práce je zaměřena na porovnání metod a buněčných modelů pro studium osteodiferenciace, které budou v budoucnu využity pro studium nových biomateriálů pro ortopedické aplikace. Byly použity 2 buněčné modely: buněčná osteosarkomatická linie SaOS-2 a imortalizované kmenové buňky hTERT-ASC. Pro indukci osteodiferenciace bylo použito osteodiferenciační médium komerční (neznámé složení) a námi připravené. Po kultivaci 7 a 14 byla sledována osteodiferenciace barvením depotu Ca2+ Alizarinovou červení (ARS), stanovením aktivity alkalické fosfatasy (ALP) a imunochemicky - byl stanoven protein osteopontin (OPN). U buněčné linie SaOS-2 po 14 dnech u ARS byla mikroskopicky i kvantitativně prokázána zvýšená depozice Ca (až 14krát oproti kontrole) a aktivita ALP byla také signifikantně zvýšená. U buněk hTERT zatím nebylo ani v jednom typu média dosaženo dostatečné odpovědi jak u ALP (aktivita cca 300krát nižší než u SaOS-2), tak u ARS (téměř 50krát nižší odezva). Jako nejlepší metoda pro sledování osteodiferenciace se jeví ARS, ale ARS nebude možné použít na hydroxyapatitových materiálech. Proto je nutné optimalizovat metodu ALP. Do budoucna je v plánu imunofluorescenční mikroskopie a imunochemické stanovení proteinů (kolagen a ALP).
|