|
9:00
|
Bc.
Milada
Suková
|
M2
|
Ing. Sabina Purkrtová, Ph.D.
|
Využití MALDI-TOF MS a PCR pro detekci rezistence k betalaktamovým antibiotikům u Salmonella spp.
|
detail
Využití MALDI-TOF MS a PCR pro detekci rezistence k betalaktamovým antibiotikům u Salmonella spp.
Zvyšující se rezistence bakterií k antibiotikům patří mezi vážné problémy současné doby. Bakterie rodu Salmonella jsou původcem mnoha onemocnění u člověka i zvířat. Jedná se o alimentární onemocnění jako je salmonelóza, tyfus a paratyfus. Mezi významné mechanismy rezistence Salmonella spp. patří i produkce betalaktamas, které hydrolyzují betalaktamová antibiotika. Fenotypové metody stanovení rezistence k antibiotikům jsou obecně náročné na čas, práci i materiál. Vhodnou alternativou, zaváděnou v posledních letech je stanovení rezistence k antibiotikům metodou hmotnostní spektrometrie MALDI-TOF MS, jejíž zavedení a ověření patřilo i mezi cíle této práce. V práci bylo použito celkem 8 kmenů Salmonella spp. U těchto kmenů byla provedena PCR detekce přítomnosti genů vybraných betalaktamas (blaTEM, blaPSE, blaSHV, ampC a blaCTX-M-1 ) s různě širokým spektrem účinku. Přítomnost těchto genů byla porovnána s fenotypově stanovenou rezistencí k 27 antibiotikům (z toho 18 betalaktamových) pomocí diskové difúzní metody. Pro zavedení detekce rezistence k betalaktamovým antibiotikům metodou MALDI-TOF MS bylo testováno antibiotikum ampicilin, jehož degradační produkty byly opakovaně detekovány u čtyřech z pěti kmenů Salmonella spp. rezistentních k ampicilinu.
|
|
9:00
|
Bc.
Štěpánka
Plochá
|
M2
|
Ing. Sabina Purkrtová, Ph.D.
|
Využití MALDI-TOF MS pro detekci mutací genu gyrA u Salmonella spp.
|
detail
Využití MALDI-TOF MS pro detekci mutací genu gyrA u Salmonella spp.
Bakterie rodu Salmonella z čeledi Enterobacteriaceae patří mezi významné potravinové patogeny a jejich vzrůstající rezistence k chinolonovým antibiotikům je proto značný problém. Mezi geny zodpovědné za tuto rezistenci patří i gen gyrA, kódující podjednotku A topoisomerasy gyrasa. Pokud se v úseku QRDR (oblast určující rezistenci k chinolonům) tohoto genu vyskytnou určité jednobodové mutace, nejsou již některé chinolony schopny se na gyrasu vázat, takže se k nim bakterie stává rezistentní. Cílem naší práce je proto zavést jednoduchý a rychlý protokol pro detekci těchto mutací genu gyrA u Salmonella spp. metodou MALDI-TOF MS.
Celkem bylo studováno 8 kmenů Salmonella spp. sérotypů Enteritidis a Typhimurium, u nichž byla ověřena rezistence k ciprofloxacinu a kyselině nalidixové, stanoveny příslušné MIC a provedena sekvenace části genu gyrA, obsahující QRDR. Pro zavedení MALDI-TOF MS protokolu byl vybrán kmen S. Enteritidis CCM 7189. Testovány byly různé metody izolace DNA a nutnost přečištění PCR produktu před jeho amplifikací v přítomnosti dideoxynukleotidů za pomoci primerů, navržených na základě in silico analýzy. Získaná hmotnostní spektra umožnila správně stanovit nejméně 3 nukleotidy následující za primerem, díky čemuž byly spolehlivě detekovány 2 časté mutace (Asp82 a Ser83).
|
|
9:00
|
Bc.
Kateřina
Hrušková
|
M2
|
doc. Mgr. Ing. Štěpánka Kučková, Ph.D.
|
Rozlišení druhů mykobakterií ve vodě pomocí hmotnostní spektrometrie MALDI-TOF
|
detail
Rozlišení druhů mykobakterií ve vodě pomocí hmotnostní spektrometrie MALDI-TOF
Většina bakterií rodu Mycobacterium se řadí mezi podmíněné patogeny způsobující závažná plicní onemocnění tuberkulózy a mimoplicní onemocnění zvané mykobakteriózy. V současné době je v České republice jejich největší rozšíření na Karvinsku. Mykobaktérie se vyznačují dlouhou generační dobou s pomalým růstem na kultivačních půdách, proto se do popředí dostává rychlá identifikace pomocí hmotnostní spektrometrie. Tato práce se zabývá rozlišením druhů mykobakterií ve vzorcích vody. Pomocí hmotnostní spektrometrie MALDI-TOF se pokoušíme analýzou hlavních komponent (PCA) rozlišit jednotlivé druhy mykobakterií ve standardních vzorcích a vzorcích vody. Od dvou dodavatelů máme k dispozici druhy M. mucogenicum, M. fortuitum, M. peregrinum, M. celatum, M. abcessus, M. chelanoe, M. kansassi, M. marinum, M. avium subs. avium, M. avium subs. hominissuis, M. intracellulare, M. gordonae, M. xenopi a M. tuberculosis. Z důvodu kultivace mykobakterií na vaječném žloutku u jednoho z dodavatelů, jsme se rozhodli pracovat pouze s referenčními vzorky druhého dodavatele a následně je porovnávat s reálnými vzorky vody. Dosavadní výsledky ukázaly, že jednotlivé druhy mykobakterií standardních vzorků lze spolehlivě rozlišit a obdobné výsledky očekáváme i u modelových vzorků vody.
|
|
9:00
|
Bc.
Tereza
Pánková
|
M2
|
Ing. Michal Strejček, Ph.D.
|
Reprodukovatelnost proteinových signálů v hmotnostně spektrometrické analýze bakteriálních buněk
|
detail
Reprodukovatelnost proteinových signálů v hmotnostně spektrometrické analýze bakteriálních buněk
Hmotnostní analýza MALDI-TOF je citlivá analytická metoda, vhodná k identifikaci bakterií. V mikrobiologii životního prostředí se snažíme zejména o taxonomické charakterizace velkého množství bakteriálních izolátů, současně však chceme od sebe separovat blízce příbuzné bakteriální druhy dle rozdílného proteinového profilu. Při analýze bakteriálních kultur se však někdy potýkáme s odlišností hmotnostních spekter biologických replik. Jedním z důvodů může být např. složení buněčné stěny, či různá růstová fáze kultury, což může mít za následek problém s uvolněním intracelulárních proteinů při lyzi buněk. Před vyhodnocením těchto vlivů je potřeba zajistit reprodukovatelnost přípravy vzorku, která se sama podílí na kvalitě získaných spekter.
Cílem prezentované práce bylo najít vhodné parametry extrakce bakteriálních proteinů pro analýzu pomocí hmotnostní spektrometrie MALDI-TOF. Pro experiment byly zvoleny dva bakteriální kmeny jeden ze zástupců G+ a druhý G-. Sledovali jsme vliv doby působení extrakčních činidel na zisk proteinů a vliv koncentrace extrahovaných proteinů na kvalitu hmotnostních spekter. Získaná data nám umožnila standardizovat přípravu vzorků k pozorování biologické reprodukovatelnosti hmotnostních spekter.
|
|
9:00
|
Bc.
Anna
Jelínková
|
M2
|
Ing. Ludmila Karamonová, Ph.D.
|
Identifikace druhů u rodu Cronobacter pomocí hmotnostní spektrometrie
|
detail
Identifikace druhů u rodu Cronobacter pomocí hmotnostní spektrometrie
Bakterie rodu Cronobacter patří mezi oportunní patogeny vzájemně se lišící svou virulencí. Jejich nebezpečí spočívá hlavně v kontaminaci sušené kojenecké výživy. Nejrizikovější skupinou jsou novorozenci s nízkou porodní váhou, u kterých může bakterie způsobit závažná onemocnění. Proto je jejich identifikace na úrovni rodu i druhu důležitá. MALDI-TOF MS je metodou, která umožňuje rychlou a spolehlivou identifikaci bakterií na základě porovnání proteinových profilů intaktních buněk. Stávající databáze mikroorganismů Biotyper umožňuje identifikaci Cronobacter pouze na rodové úrovni. Cílem práce je vytvoření databáze rozlišující i jednotlivé druhy Cronobacter. Základem pro sestavení vlastní databáze je zisk kvalitních spekter. Proto byla testována kultivační média, doby kultivace a metody přípravy vzorku, tedy intaktních buněk a extraktů. Nejlepší variantou bylo měření intaktních buněk v kombinaci s pevným médiem TSA a 24hod kultivací. Pro sestavení databáze Cronobacter bylo vybráno 20 reprezentativních spekter pomocí analýzy hlavních komponent s následnou tvorbou sumárních spekter (MSP) dosud pro 30 sbírkových kmenů. Databáze bude rozšířena pro pokrytí rozmanitosti rodu Cronobacter a bude vytvořena v programech Biotyper a BioNumerics s ověřením funkčnosti na klinických izolátech.
|
|
9:00
|
Bc.
Kristýna
Zítková
|
M2
|
doc. Mgr. Ing. Štěpánka Kučková, Ph.D.
|
Ověřování živočišného původu mlék použitých při výrobě sýrů pomocí MALDI-TOF MS
|
detail
Ověřování živočišného původu mlék použitých při výrobě sýrů pomocí MALDI-TOF MS
Pojmem sýr je označována skupina fermentovaných mléčných produktů, které jsou vyráběny po celém světě v různých formách a příchutích. Velké množství sýrů je vyráběno ze stejných surovin, obvykle z kravského, kozího nebo ovčího mléka, bakterií mléčného kvašení, koagulantu a chloridu sodného. Právě druh mléka by nám měl posloužit jako prvek, na základě kterého budeme jednotlivé sýry rozlišovat. Hlavním cílem naší práce je zjistit, zda se na trhu s potravinami nacházejí zfalšované výrobky, či zda výrobci částečně nenahrazují kvalitní suroviny levnější variantou. K tomuto účelu bychom chtěli využít hmotnostní spektrometrii MALDI-TOF. Jak jsme si již dříve ověřili, pomocí této techniky je možné rozlišit jednotlivé typy živočišných mlék. Nyní bylo potřeba zjistit, jestli lze stejnou metodu aplikovat i na sýry. K jejich analýze jsme použili enzym trypsin a po proměření izolovaných peptidů hmotnostním spektrometrem jsme se pokusili vzorky rozlišit metodou analýzy hlavních komponent (PCA). Předpokládali jsme, že by mohlo dojít k rozlišení sýrů na základě použitého mléka, získali jsme však ne zcela uspokojivé výsledky, pravděpodobně z důvodu přítomnosti velkého množství přídatných látek v sýrech. Nyní se pokoušíme získat uspokojivější výsledky pomocí LC-ESI-Q-TOF techniky.
|
|
9:00
|
Bc.
Gabriela
Daníčková
|
M2
|
Ing. Ludmila Karamonová, Ph.D.
|
Charakterizace a identifikace cytosolických proteinů u jednotlivých druhů Cronobacter.
|
detail
Charakterizace a identifikace cytosolických proteinů u jednotlivých druhů Cronobacter.
Bakterie rodu Cronobacter se řadí mezi oportunní patogeny, u kterých byla prokázána spojitost s alimentárními a nozokomiálními infekcemi. Především u novorozenců a imunodeficientních jedinců mohou tyto bakterie způsobit meningitidy, sepse a nekrotizující enterokolitidy. Nákazy nejsou příliš časté, vykazují však vysokou letalitu. Mírou virulence se jednotlivé druhy liší. Z klinických vzorků byly nejčastěji izolovány druhy C. sakazakii, C. malonaticus a C. turicensis. Výzkum těchto bakterií je v současné době zaměřen na charakterizaci a identifikaci faktorů virulence. Identifikace potenciálně virulentních proteinů by mohla přispět k objasnění procesu patogeneze těchto bakterií a následně by mohla být využita k vývoji specifických imunochemických identifikačních metod, jakými jsou například metody ELISA. V rámci této práce byla nejprve nalezena vhodná metoda pro stanovení koncentrace proteinů obsažených v cytosolických frakcích. Po charakterizaci pomocí SDS-PAGE byly přítomné proteiny identifikovány metodou hmotnostní spektrometrie (LC-ESI-Q-TOF MS) a prostřednictvím in silico analýzy byla určena jejich buněčná lokalizace a biologická funkce.
|
