|
---
|
Bc.
Michaela
Hromádková
|
M2
|
Ing. Markéta Častorálová, Ph.D.
|
Příprava fúzních retrovirových polyproteinů pro studium aktivace proteasy M-PMV in vitro
|
detail
Příprava fúzních retrovirových polyproteinů pro studium aktivace proteasy M-PMV in vitro
Infekčnost retrovirových částic je podmíněna štěpením retrovirových polyproteinů na jednotlivé strukturní proteiny a enzymy pomocí virové proteasy. V důsledku štěpení dochází k přestavbě virové částice a změnám v jejím vnitřním uspořádání. Z dřívějších výzkumů je známo, že proteolýza podléhá přísné regulaci, ale mechanismus aktivace proteasy nebyl doposud uspokojivě objasněn.
V této práci byl použit DNA konstrukt kódující fúzní polyprotein složený z kapsidové, nukleokapsidové a p4 domény Gag Masonova-Pfizerova opičího viru (M-PMV), který obsahuje na C-konci M-PMV proteasu (M-CANC-p4-PR). Tento vektor byl použit pro produkci M-CANC-p4-PR v bakteriálním expresním systému E. coli BL 21 (DE3). Připravený fúzní protein měl být použit pro studium aktivace proteasy in vitro. Analýzou vzorků z produkce a izolace tohoto fúzního proteinu se však ukázalo, že již v bakteriálních buňkách dochází k jeho štěpení. V současné době probíhá příprava vektoru pro produkci M-CANC-p4-PR s inaktivní proteasou pro ověření hypotézy, že štěpení polyproteinu by mohlo být způsobeno aktivací proteasy již v bakteriálních buňkách.
|
|
---
|
Bc.
Miroslava
Mecová
|
M2
|
Ing. Jan Prchal, Ph.D.
|
Interakce matrixového proteinu M-PMV s kalmodulinem
|
detail
Interakce matrixového proteinu M-PMV s kalmodulinem
Kalmodulin je malý, všudypřítomný, vysoce konzervovaný protein, který se podílí na regulaci základních buněčných procesů u všech eukaryot. Bylo prokázáno, že kalmodulin interaguje s polyproteinem Gag, strukturní komponentou retroviru HIV-1, během pozdní fáze jeho životního cyklu v infikované buňce, a to skrze N-terminálně myristoylovaný matrixový protein myr(+) MA. Interakce kalmodulinu s Gag má za následek expozici kyseliny myristové matrixového proteinu a následný transport Gag k membráně a asociaci s ní, tedy klíčové kroky v životním cyklu retroviru HIV-1. Předmětem práce je výzkum interakce kalmodulinu s matrixovým proteinem Mason-Pfizerova opičího viru M-PMV. Během své bakalářské práce jsem prokázala, že M-PMV MA s kalmodulinem interaguje, a nyní se snažím určit strukturu jejich komplexu. Rekombinantní kalmodulin a dusíkem značený matrixový protein byly připraveny kultivací transformovaných buněk Escherichia coli BL21. Pomocí termoforézy byla ověřena interakce. MA jsme titrovali kalmodulinem a pro jednotlivé vzorky byla naměřena 1H 15N HSQC spektra. Sledováním změn chemických posunů HN skupin byly identifikovány aminokyseliny interakčního rozhraní na MA. Dalším krokem bude určení aminokyselin interakčního rozhraní na kalmodulinu.
![]()
|
|
---
|
Bc.
Michal
Sončík
|
M2
|
Ing. Silvie Rimpelová, Ph.D.
|
Mechanismus reaktivace latentního HIV-1 pomocí hem arginátu
|
detail
Mechanismus reaktivace latentního HIV-1 pomocí hem arginátu
HIV-1, virus lidské imunodeficience, kterému podlehnou ročně více než 2 miliony lidí se stále úspěšně vyhýbá imunitní odpovědi. Akutní infekci HIV-1 lze zmírnit pomoci kombinované antivirové léčby, která však nedokáže úplně eliminovat HIV-1 kvůli latentně infikovaným buňkám, které nejsou rozpoznávány imunitním systémem ani antiretrovirotiky. Jednou z možností odstranění latentních buněk je reaktivace HIV-1 proviru a následná eliminace latentně infikovaných buněk.
Hem arginát obsahuje lidský hemin a používá se na léčbu akutní porfyrie. Bylo známo, že hemin samotný může zmírnit infekci HIV-1 in vitro. V naší laboratoři bylo ukázáno, že hem arginát podobně jako hemin inhibuje reverzní transkripci HIV-1 a navíc zesiluje PMA stimulovanou reaktivaci proviru HIV-1 v ACH-2, klonech Jurkat a v periferních mononukleárech (PBMC’s). Působí jako latenci revertující agens (LRA) a spolu s PMA, také jako stimulátor exprese HO-1.
Cílem výzkumu je studovat vliv vybraných redox-senzitivních faktorů, jejichž funkce může být regulována hemem, na reaktivaci latentního HIV-1 a charakterizace nově připravené T-lymfocytární linie odvozené od A2 klonu Jurkat obsahujícího latentní HIV-1 ,,minivirus‘‘, které byly stabilně transfekovány vektory exprimujícími jednotlivé faktory.
|
|
---
|
Bc.
Lucie
Hodboďová
|
M1
|
Ing. Markéta Častorálová, Ph.D.
|
Příprava HIV-1 proteasy a fúzních proteinů odvozených od matrixového a kapsidového proteinu viru HIV-1 pro studium jejich interakce
|
detail
Příprava HIV-1 proteasy a fúzních proteinů odvozených od matrixového a kapsidového proteinu viru HIV-1 pro studium jejich interakce
Maturace je stěžejním krokem životního cyklu retrovirů, včetně viru HIV-1, při kterém dochází k přeměně neinfekčních nezralých virových částic na infekční zralé částice. V procesu katalyzovaném virovou proteasou dochází k sekvenčnímu štěpení retrovirových polyproteinů na jednotlivé strukturní proteiny a enzymy. Přesný mechanismus tohoto štěpení zůstává zatím neobjasněn, ačkoliv je virus HIV-1 znám od roku 1983.
HIV-1 proteasa není sekvenčně specifická a předpokládá se, že rozpoznání cílových sekvencí by mohlo být umožněno její interakcí s globulárními doménami polyproteinu Gag. Cílem práce je studium interakce virové proteasy s fúzními proteiny odvozenými od polyproteinu Gag, které se liší právě přítomností globulární domény po stranách štěpného místa. Pro studium této interakce bylo nutné připravit aktivní proteasu HIV-1 a tři fúzní proteiny. Tyto proteiny se skládají z matrixového proteinu a N-terminální domény kapsidového proteinu viru HIV-1, mezi kterými se nachází štěpné místo pro proteasu, nebo pouze z jednoho proteinu a fragmentu druhého. Byly připraveny potřebné vektory a požadované proteiny byly produkovány a izolovány. Následně bude provedeno štěpení připravených fúzních proteinů a bude sledován vliv přítomnosti globulárních domén na štěpení těchto proteinů proteasou.
|
|
---
|
Bc.
Tomáš
Duchoň
|
M2
|
Ing. Markéta Častorálová, Ph.D.
|
Studium sekvečního štěpení N-terminálního fragmentu polyproteinu Gag viru HIV-1
|
detail
Studium sekvečního štěpení N-terminálního fragmentu polyproteinu Gag viru HIV-1
Nezralá virová částice viru HIV-1 se v hostitelské buňce skládá na cytoplasmatické membráně, přes kterou posléze pučí a procesem zvaným maturace vzniká nová částice. Hlavní strukturní polyprotein viru HIV-1 se nazývá Gag a během maturace je virovou proteasou štěpen na jednotlivé strukturní proteiny. Polyprotein Gag se skládá z matrixové (MA) a kapsidové (CA) domény, peptidu SP1, nukleokapsidové (NC) domény, peptidu SP2 a domény p6. MA doména je myristoylována a může se nacházet ve dvou konformacích, se zbytkem kyseliny myristové zanořeným do MA nebo exponovaným ze struktury MA (myristoylový přepínač).
Polyprotein Gag je štěpen sekvenčně za vzniku fragmentu MACASP1, který je štěpen na MA a CASP1 a posledním krokem je odštěpení peptidu SP1. Blokací odštěpení MA od CA v důsledku mutace je negativně ovlivněno i odštěpení SP1. Podobný efekt byl pozorován u mutantu MA V7R se zablokovaným myristoylovým přepínačem. Cílem této práce je příprava N-terminálního fragmentu Gag MACASP1 pro studium sekvenčního štěpení a vlivu myristoylového přepínače na štěpení.
Byly připraveny vektory pro produkci MACASP1 a MA(V7R)CASP1 pro produkci v bakteriálních buňkách a oba tyto proteiny byly produkovány v myristoylované formě. Bylo provedeno štěpení, jehož analýza potvrdila sekvenční štěpení MACASP1.
|
|
---
|
Bc.
Aneta
Pagáčová
|
M2
|
prof. Ing. Tomáš Ruml, CSc.
|
Příprava magneticky naváděných virům podobných částic a ověření jejich funkčnosti
|
detail
Příprava magneticky naváděných virům podobných částic a ověření jejich funkčnosti
Virům podobné částice (VLPs) jsou proteinové nanostruktury složené z virových strukturních proteinů, které ale postrádají virový genom a katalytické proteiny potřebné k replikaci viru. Tím jsou schopné napodobit některé vlastnosti virů jako spontánní skládání do vysoce organizovaných struktur, interakce s nukleovou kyselinou a proteiny nebo schopnost průniku do buněk. Protože ale neobsahují virový genom, nejsou infekční. Díky všem těmto vlastnostem mají VLPs velký potenciál v cílené dopravě molekul do tkání. V posledních letech dochází k velkému rozvoji oblasti biomedicíny zabývající se cílenou dopravou léčiv zejména při nádorových onemocněních, což má za následek omezování negativních vedlejších účinků plynoucích z protinádorové léčby. Cílem této práce je příprava VLPs obsahujících magnetické kovy, které by bylo možné magneticky navádět do cílových buněk, a ověření jejich funkčnosti. K přípravě VLPs je použit fúzní protein Mason-Pfizerova opičího viru tvořený kapsidovou doménou bez N-terminálního prolinu a nukleokapsidovou doménou obsahující ve své struktuře dva motivy zinkových prstů. Tvorba VLPs s různými magnetickými kovy byla ověřena pomocí transmisní elektronové mikroskopie. Navádění VLPs bylo testováno v magnetickém poli.
|
|
---
|
Bc.
Henrietta
Ottová
|
M2
|
Ing. Jan Prchal, Ph.D.
|
Interakce integrasy Mason-Pfizerova opičího viru se strukturními proteiny virové částice
|
detail
Interakce integrasy Mason-Pfizerova opičího viru se strukturními proteiny virové částice
Retroviry jsou živočišné viry, jež jsou příčinou nejen lidských onemocnění. Kvůli léčbě je proto zásadní porozumět jejich životnímu cyklu. Jedním ze zásadních kroků jejich životního cyklu je začlenění retrovirového genomu do genomu hostitele. Tento krok zajišťuje enzym integrasa. Poslední výzkumy ukazují, oproti dřívějším hypotézám, že do jádra kromě preintegračního komplexu, jehož součástí je integrasa, vstupuje i kapsidový protein. Náš výzkum se proto zabývá interakcemi integrasy Masonova-Pfizerova opičího viru (M-PMV), jakožto modelového retroviru, se strukturními proteiny M-PMV, konkrétně kapsidovým a matrixovým proteinem. Tyto interakce jsou studovány pomocí termoforézy, princip této metody je založen na pohybu molekul v teplotním gradientu. Dle dosavadních výsledků lze předpokládat, že integrasa M-PMV interaguje jak s kapsidovým, tak s matrixovým proteinem M-PMV. Kromě toho je studován i vliv nukleových kyselin na tyto interakce, který se zatím nejeví jako podstatný. Výsledky měření pomocí termoforézy se v budoucnu pokusíme ověřit i pomocí dalších metod, např. fluorescenční anizotropie.
|
