Studentská vědecká konference

Tuková tkáň je mohutným sekrečním orgánem, který produkuje značné množství biologicky aktivních látek, tzv. adipokinů. Dysbalance v produkci adipokinů vede k rozvoji obezity a diabetes mellitus 2. typu. Nikotinamidfosforibosyltransferasa (Nampt) je enzym účinkující v syntéze NAD a bývá též prezentována jako adipokin s insulin-mimetickým působením. Naším dlouhodobým cílem je zjistit, zdali jsou účinky Nampt jako adipokinu zprostředkované její enzymovou aktivitou nebo nikoliv. V rámci této práce jsme sledovali vliv Nampt na adipogenezi 3T3-L1, a to ověřením vlivu Nampt na akumulaci triacylglycerolů (TAG). Pro toto zjištění jsme použili preadipocyty 3T3-L1 se stabilně zvýšenou produkcí Nampt v enzymově aktivní (Nampt-WT) a neaktivní (Nampt‑D311A+R313A) formě a kontrolní linii 3T3-L1 s běžnou produkcí Nampt. Preadipocyty se všemi variantami Nampt podstoupily proces diferenciace v adipocyty. Prostřednictvím Oil Red O a enzymatickým kitem jsme stanovili, že obsah intracelulárních TAG se mezi adipocyty s variantami Nampt neliší, avšak adipocyty s variantou Nampt‑WT produkují vyšší množství extracelulárních TAG oproti kontrolní linii 3T3-L1 a Nampt‑D311A+R313A. Výsledky naznačují, že působení Nampt na metabolismus tukové tkáně je pravděpodobně zapříčiněné enzymovou aktivitou.

Především kvůli stále se rozvíjejícímu potravinářskému, farmaceutickému a kosmetickému průmyslu, přicházíme do kontaktu s toxickými látkami čím dál častěji, což zvyšuje poptávku po rychlém a kvalitním systému testování nežádoucího genotoxického potenciálu. Regulačními orgány doporučované testy genotoxicity právě v rychlosti a kapacitě často zaostávají, a proto roste snaha validovat nové přístupy. Jednou z možností by mohlo být sledování vzniku fosforylovaného histonu 2AX (γH2AX), jehož množství odráží míru poškození DNA. Naším cílem je s využitím γH2AX navrhnout in vitro postup pro vysokokapacitní testování genotoxicity na savčích buňkách. Potenciálně genotoxické látky testujeme v 96-jamkové destičce na buněčné linii HeLa. Aplikujeme metodu, při které je detekce γH2AX zprostředkována komerčně dostupnými fluorescenčně značenými specifickými protilátkami s následným vyhodnocením pomocí fluorescenční mikroskopie. Konkrétně na snímcích hodnotíme intenzitu fluorescence jednotlivých buněk. Po slibných výsledcích s testováním valinomycinu, jako pozitivní kontroly pro vznik zlomů DNA, chceme nyní přejít k testování dalších vzorků a pokusit se o snížení finančních nákladů na analýzu. Zároveň stále zdokonalujeme analýzu obrazu pro rychlé a automatizované zpracování fluorescenčních snímků.

Jedním z faktorů komplikujících hojení chronických ran je přítomnost senescentních buněk (fibroblasty), které se chovají prozánětlivě a neplní svou funkci v hojení rány. Současné modely, které se používají ve výzkumu látek podporujících hojení chronických ran, však většinou používají nesenescentní fibroblasty. Tato práce se zabývá přípravou, charakterizací a zavedením senescentních fibroblastů do laboratorního 3D modelu chronické rány. U primárních kožních fibroblastů byla indukována senescence působením peroxidu vodíku. Před inkorporací do kolagenového gelu byla senescence u lidských fibroblastů potvrzena nárůstem β-galaktosidasové aktivity, signálu γH2AX, změnou morfologie a genové exprese prozánětlivého IL-1β, IL-8 a MMP3. Po inkorporaci do gelu bylo zachování senescentního fenotypu potvrzeno genovou expresí prozánětlivých IL-1β, IL-6, IL-8, MMP1 a MMP3, a signálu γH2AX. Podařilo se indukovat a potvrdit senescenci u lidských fibroblastů, které byly dále inkorporovány do kolagenu. Tato vrstva simulované dermis se osadí vrstvou keratinocytů. Dále bude vytvořen model rány a sledován vliv senescence na migraci nesenescentních fibroblastů. Po zavedení modelu bude možné relevantněji sledovat vliv nových přípravků, které by mohly usnadnit proces hojení lidských chronických ran.

Výzkum kostní tkáně je klíčovou oblastí při vývoji nových biomateriálů pro ortopedické aplikace. Vhodným modelem kostních buněk pro testování in vitro je komerčně dostupná buněčná linie hFOB 1.19, která představuje adherentní lidské osteoblasty připravené transfekcí pomocí teplotně senzitivního T-antigenu SV40. Cílem této práce je porovnání buněčné linie hFOB 1.19 s často používanou linií Saos-2 odvozenou od lidského osteosarkomu při dlouhodobé kultivaci za různých kultivačních podmínek, a dále zjištění jejich citlivosti vůči zinečnatým iontům. Naše dosavadní výsledky prokázaly nižší citlivost buněk hFOB 1.19 k Zn²⁺ iontům v porovnání s linií L929, která je pro testy cytotoxicity přímo doporučena normou. Předběžné výsledky dlouhodobé kultivace naznačují, že buňky hFOB 1.19 nevykazují tak výraznou aktivitu alkalické fosfatasy a mineralizace ECM jako linie Saos-2. Znaky diferenciace jsou však pozorovatelné již při kultivaci ve 37°C, navíc bez přítomnosti selekčního činidla, což bude zohledněno v dalších testech.

Vestibulární schwannom je nejčastěji se vyskytující benigní nádor ve vnitřním uchu. Skládá se ze Schwannomových buněk nacházejících se ve Vestibulokochleárním nervu. Nejčastějšími projevy onemocnění je ztráta stability, šelest v uchu, která přechází až do hluchoty a pokud se nádor neodstraní včas, může následovat i obrna dalších hlavových nervů. Vestibulární schwannom byl již studován pomocí diferenční gelové elektroforézy i pomocí hmotnostní spektrometrie na principu MALDI-TOF. Náš tým analyzuje Vestibulární schwannom a okolní tkáně metodou specifického štěpení proteinů trypsinem přímo ve vzorku následovaného tandemovou hmotností spektrometrii. Zatím se podařilo identifikovat zhruba 500 proteinů ve vzorku, z nichž některé mají zajímavé biologické nebo klinické role včetně spojitosti s nádorovým bujením.

Perspektivním modelovým systémem kostních buněk je buněčná linie lidských fetálních osteoblastů hFOB 1.19. Jedná se o preosteoblasty transfekované genem kódujícím tepelně senzitivní velký T antigen z opičího viru SV40 a genem pro rezistenci k neomycinu. Pro tuto buněčnou linii jsou charakteristické dvě kultivační teploty: permisivní teplota (34 °C), při které se buňky rychle dělí, dochází k expresi vneseného genu – buňky zůstávají ve formě preosteoblastů a teplota restriktivní (39,5 °C), při níž buňky diferencují. Při diferenciaci dochází k produkci osteopontinu, osteonektinu, kostního sialoproteinu, alkalické fosfatasy a kolagenu typu I. Pomocí jejich hladin lze sledovat fáze diferenciace osteoblastů. V našich experimentech jsme sledovali hladiny proteinů buněk hFOB 1.19 kultivovaných při teplotě 34, 39,5 a dále standardních 37 °C. Pro identifikaci proteinů byly vzorky podrobeny LC-MS/MS analýze, poté byla provedena label-free kvantifikace. Ukázalo se, že při kultivaci v restriktivní teplotě byla zvýšená hladina kolagenu typu I a enzymů, které se podílejí na jeho tvorbě a modifikaci. Dále byly nalezeny zvýšené hladiny proteinů tepelného šoku a proteinů účastnících se odpovědi na buněčný stres. Hladiny jaderných proteinů byly snížené.

Rohovka je průhledná membrána, která tvoří jednu šestinu oční bulvy a je zodpovědná za lom světla vstupujícího do oka. Skládá se z pěti různých vrstev a každá z nich obsahuje specifické typy kolagenů, elastinu, fibronektinů, lamininů a proteoglykanů. Degradace rohovky je spojena se sníženou schopností odolávat širokému spektru fyziologických stresů. Změny na povrchu oka vlivem stárnutí rohovky způsobují větší náchylnost oka k infekci. Se zvyšujícím se věkem dochází ke zvýšení propustnosti epitelu, které může snížit funkci epiteliální bariéry. Cílem této práce je pomocí pokročilých metod infračervené a Ramanovy spektroskopie odhalit specifické změny v chemickém složení rohovky během její degradace. Izolované prasečí rohovky byly skladovány ve čtyřech různých roztocích (destilovaná voda, roztok na kontaktní čočky, Eusol-C a Tissue-C) a následně měřeny v konkrétních časových intervalech. Získaná spektra byla poté vyhodnocena vícerozměrnými statistickými metodami. Výsledky tohoto měření by měly být zohledněny při výběru vhodného uchovávajícího média například při transplantaci očních rohovek.