Studentská vědecká konference

Rezistence vůči karbapenemům, širokospektrým 𝛽-laktámovým antibiotikům, je závažným celosvětovým problémem, který ohrožuje léčbu bakteriálních infekcí způsobených nejen nozokomiálními patogeny. Rezistence ke karbapenemům vzniká především produkcí karbapenemas, což jsou bakteriální hydrolytické enzymy schopné štěpení jak nových generací karbapenemů, tak i řady penicilinů a cefalosporinů. V případě úspěšné inhibice těchto enzymů by se již zavedená 𝛽-laktámová antibiotika stala znovu účinnými v boji proti bakteriálním infekcím způsobených ESBL kmeny. Tato práce se věnuje rekombinantní produkci a izolaci karbapenemasy 3 (KPC-3) z Klebsiella pneumoniae, její charakterizaci a studiu její inhibice deriváty kyseliny borité. Za účelem studia inhibičního potenciálu borátových sloučenin byla KPC-3 podrobena řadě testů enyzmové aktivity v jejich přítomnosti. Bylo odhaleno, že hned několik sloučenin vyvolává slibný inhibiční efekt, kde byla pozorována snížená rychlost štěpení 𝛽-laktámového antibiotika jakožto substrátu. Tato zjištění nabízejí slibnou cestu k řešení rezistence vůči karbapenemům, konkrétně v souvislosti s ESBL kmeny produkujícími KPC-3 a potenciálním budoucím terapeutickým využitím identifikovaných inhibitorů.  

Mykobakteriální inosin-5‘-mononofosfát dehydrogenasa (IMPDH) je považována za slibný cíl pro vývoj antimikrobiálních látek. IMPDH je regulačním enzymem v metabolismu purinových bází vedoucí k syntéze GTP. Katalyzuje konverzi inosin-5‘-monofosfátu na xantosin-5‘-monofosfát za současné redukce NAD⁺. IMPDH se vyskytuje ve formě oktameru, ve kterém jsou jednotlivé protomery provázány pomocí C-konců tak, že C-konec první podjednotky zasahuje až k aktivnímu místu té další. Toto provázání v rámci oktameru by mohlo mít vliv na pozorované kooperativní chování enzymu, přesná molekulární funkce C-konců ale není známá. Práce se zabývá strukturní charakterizací C-konců IMPDH z Mycobacterium smegmatis a jejich významu pro aktivitu enzymu. Na základě strukturní analýzy byla navržena sada bodových mutací C-koncových zbytků, které se účastní interakcí s aktivním místem. Metodologie zahrnovala přípravu bakteriálních expresních vektorů pro sadu vybraných mutantů. Následovala heterologní exprese těchto mutantů v E. coli a purifikace exprimovaných proteinů pomocí imobilizační metalo-afinitní chromatografie. Nyní probíhá analýza reakční kinetiky mutantů pro zhodnocení vlivu mutací na enzymatickou aktivitu IMPDH. Tento projekt může přispět k lepšímu porozumění reakčního mechanismu IMPDH.

Beta-galaktosidasy jsou běžně biotechnologicky využívané enzymy. Jejich schopnost hydrolyzovat laktosu je široce využívána při výrobě bezlaktosových potravin nebo pro řešení environmentálních problémů spojených s odpadní syrovátkou. Kromě hydrolytické aktivity vykazují některé z těchto enzymů schopnost katalyzovat transglykosylační reakce, jejichž produkty jsou například prebiotika ve formě galaktooligosachridů. Schopnost transglykosylace je předpovězena zařazením proteinu do rodiny glykosylhydrolas s mechanismem se zachováním anomerní konfigurace. Rychlejší katalýza, vyšší afinita k substrátu či aktivita při extrémních podmínkách jsou důvody pro hledání nových zdrojů beta-galaktosidas. V této práci je studována beta-galaktosidasa z rodiny glykosylhydrolas 2, pro kterou je na základě struktury předpovězena transglykosylační schopnost. Gen pro tuto beta-galaktosidasu se nachází  na megaplasmidu bakterie Microscilla sp. PRE1 izolované z pobřežních sedimentů v Kalifornii. Tento gen byl vložen do plasmidu pET16b metodou Gibson Assembly a správnost konstruktu byla ověřena sekvenací. Získaný vektor byl využit pro rekombinantní produkci beta-galaktosidasy v buňkách E. coli BL21 (DE3) a E. coli BL21 (DE3) Gold. Dalšími kroky bude charakterizace a výzkum katalytických schopností enzymu.  

Masonův-Pfizerův opičí virus (M-PMV) je retrovirus z rodu Betaretrovirus. Životní cyklus M-PMV se dá rozdělit na časnou a pozdní fázi. Během pozdní fáze dochází ke skládání virové částice, jejímu transportu k buněčné membráně, pučení a následné maturaci. Během maturace nezralé virové částice dochází k sekvenčnímu štěpení virového polyproteinu Gag virovou proteasou a to vede k významným morfologickým změnám, které jsou podstatné pro vznik zralé virové částice schopné infekce nové hostitelské buňky. N-koncovou doménou polyproteinu Gag je matrixová (MA) doména, která se podílí na transportu nezralé virové částice k cytoplasmatické membráně a jejich následné interakci. Pro studium významu štěpení MA v další maturaci virové částice bylo zapotřebí ověřit, které aminokyselinové záměny ve fúzním proteinu MA-PP zabrání jeho štěpení. Tyto aminokyselinové záměny budou následně použity ke studiu maturace M-PMV in vivo. Cílem práce bylo navrhnout a připravit fůzní proteiny MA-PP M-PMV s aminokyselinovými záměnami v okolí štěpného místa a otestovat štěpení těchto proteinů virovou proteasou. Podařilo se nám ověřit, že aminokyselinové záměny A101K, A102K a M100P v MA-PP blokují jeho štěpení virovou proteasou.

MRSA, neboli Meticilin-rezistentní zlatý stafylokok, je naším nejobávanějším problémem v medicíně. Díky šíření antibiotické rezistence, se v roce 2050 přepokládá, že infekce Staphylococcus aureus bude nejčastější příčinou úmrtí (v dnešním době nejčastější příčinou úmrtí je rakovina). Cílem této práce je najít v genu enzym adenylyltransferasunu ant(4´)-Ia, který je zodpovědný za modifikaci aminoglykosidových antibiotik (například: gentamycin, kanamycin, streptomycin,…), které se využívají při léčbě zlatým stafylokokem. Mechanismus modifikace probíhá tak, že se přenáší AMP z ATP na cílové aminoglykosidové antibiotikum. V této práci jsme v databázi vyhledali sekvenci adenylyltransferasy a nechali jsme si podle ní nasyntetizovat plasmid. Poté jsme rekombinantně produkovali protein s histidovou kotvou, pročistili afinitní chromatografií, ověřili izolovaný protein pomocí Western blotu a následně jsme otestovali enzymovou aktivitu. V budoucnu chceme otestovat vybrané potenciální inhibitory, které by se mohly použít v klinické léčbě infekcí Staphylococcus aureus.  

Staphylococcus aureus je jedním z nejobávanějších patogenů dnešního světa. Jeho multirezistentní kmeny (MRSA či VRSA) se šíří obzvláště v nemocničním prostředí a způsobují stále hůře léčitelné infekce. Naději pro úspěšnou léčbu představuje tzv. adjuvantní terapie, která spočívá v inhibici konkrétního mechanismu rezistence nízkomolekulární látkou (adjuvans) a následnou léčbu infekce tím antibiotikem, které mělo být příslušným mechanismem rezistence eliminováno. Jedním z masivně rozšířených enzymů, který způsobuje rezistenci MRSA vůči mnoha aminoglykosidům, je bifunkční enzym AAC/APH (aminoglykosid-acetyltransferasa/fosfotransferasa). Po klonování příslušného genu z chromosomální DNA MRSA jsme bifunkční enzym úspěšně produkovali, purifikovali a zavedli vhodné metody pro stanovení obou jeho aktivit. Na základě pokusů s MRSA byly vybrány flavonoidní, steroidní a selenoesterové látky, u kterých byl změřen jejich inhibiční vliv na aktivitu bifunkčního AAC/APH. Dle výsledků jsme vytipovali hlavní strukturní rysy adjuvans a přibližně určili i místo jejich vazby na enzym. Získaná data budeme dále ověřovat na rozdělených strukturně-funkčních doménách bifunkčního AAC/APH. Specifitu inhibitorů ověříme také na další acetyltransferase, která způsobuje rezistenci k chloramfenikolu.

Inhibitory proteasy jsou jednou ze tříd antiretrovirových léků používaných k léčbě infekce virem HIV-1. HIV-1 proteasa je klíčový enzym v životním cyklu viru HIV-1 a je zodpovědná za štěpení virových polyproteinů na jednotlivé funkční jednotky, což je nezbytné pro tvorbu zralých infekčních částic. HIV-1 proteasa není sekvenčně specifická, avšak výskyt kompenzačních mutací v globulárních doménách polyproteinů a NMR experimenty naznačují možný vliv těchto domén na rozpoznání cílových míst štěpení. Cílem práce je studium interakce virové proteasy s fúzními proteiny odvozenými od polyproteinu Gag, které se liší přítomností globulární domény po stranách štěpného místa. Pro studium byly produkovány tři fúzní proteiny a aktivní i inaktivní forma HIV-1 proteasy. Fúzní proteiny byly navrženy tak, že jejich základem je matrixový protein a N-terminální doména kapsidového proteinu viru HIV-1, avšak liší se přítomností a počtem jednotlivých globulárních domén. Byly připraveny vektory pro produkci těchto proteinů v bakteriálních buňkách a proteiny byly produkovány a izolovány. Bylo provedeno štěpení fúzních proteinů proteasou a byl sledován vliv přítomnosti globulárních domén na štěpení. Následně bude studována interakce inaktivní proteasy s fúzními proteiny pomocí termoforézy.

Nowadays, the rapid increase of antibiotic resistance seems to be one of the most important problems we have to deal with. The deciphering of new defence mechanisms plays a crucial role in the fight against the ever-evolving bacteria. One of these newly discovered mechanisms of antimicrobial defence is the ribosome-binding ABCF proteins found in all bacterial phyla. Not only are these ATPases known to confer resistance to antibiotics by binding the 50S ribosomal subunit, but recent research has also shown that some of these proteins act as regulators of bacterial gene expression. Recently, our laboratory reported that the ABCF ATPase LmrC is an antibiotic-responsive element that can activate gene expression of the transcriptional regulator LmbU. LmbU is a key transcriptional activator of the biosynthetic lincomycin gene cluster in the antibiotic producer Streptomyces lincolnensis. In my work, I hypothesise that LmrC activates transcription of lmbU through the mechanism of ribosome-mediated attenuation. This hypothesis was strongly supported by mapping the mRNA upstream regulatory region of lmbU. Ongoing testing of prepared reporter constructs with mutations in the same regulatory region shows further confirmation of the proposed mechanism.