Studentská vědecká konference

Ektomykorhizní houba Thelephora terrestris hraje důležitou roli v lesním ekosystému, kde napomáhá rozkládat biomasu. Jedním z enzymů podílejících se na rozkladu biomasy v lesní půdě je chitinasa, s jejíž pomocí může T. terrestris rozkládat jak jiné houby, tak například exoskelet členovců. Toho lze využít pro degradaci chitinového odpadu, který vzniká rybolovem a chovem korýšů, popřípadě se dá chitin využít jako alternativní zdroj dusíku a fosforu. Jelikož tyto odpadní produkty mohou být často znečištěny těžkými kovy, je pro jejich rozklad vhodné použít zdroj chitinasy tolerantní k těžkým kovům. Tímto zdrojem by mohla být právě houba T. terrestris, která je tolerantní k těžkým kovům a zároveň vykazuje rychlý růst a chitinasovou aktivitu, což bylo ověřeno kultivací na chitinovém médiu s barevným indikátorem. Pro zjištění přibližné velikosti hledané extracelulární chitinasy bylo provedeno SDS-PAGE odstředěného kultivačního média s detekcí chitinasové aktivity metodou otisku, která se však neukázala jako dostatečně citlivá. Bylo proto přistoupeno k rozdělení kultivačního média pomocí gelové permeační chromatografie a jednotlivé frakce byly vizualizovány pomocí SDS-PAGE a podrobeny testům na chitinasovou aktivitu pomocí fluorescenčního markeru Calcofluor White a methylumbelliferonu.  

Zástupci kvasinek rodu Candida jsou součástí mikroflóry člověka a pro zdravé jedince nepředstavují riziko.  Hrozbou se stávají pro jedince s oslabeným imunitním systémem, u kterých jsou původci infekcí označovaných jako kandidosy. Patogenita kandid je způsobena především jejich schopností přizpůsobit se široké škále podmínek.  Dobře to lze dokumentovat na schopnosti kandid přežít v širokém rozmezí koncentrací oxidu uhličitého (CO₂). Adaptaci kvasinek na koncentraci CO₂ umožňují karbonické anhydrasy (CA). Tyto enzymy katalyzují probíhající reakci konverze CO₂ na bikarbonát (HCO₃^-) a regulují tím citlivě hladinu CO₂. V naší práci jsme se zaměřili na β-CA z patogenních kvasinek rodu Candida. Podařilo se vypracovat izolační postup pro přípravu CA z patogenních kvasinek Candida albicans (CaNce103p) a Candida parapsilosis (CpNce103p), pomocí kterého jsme připravili oba enzymy v dostatečném množství a čistotě potřebné k rentgenostrukturní analýze. Optimalizací krystalizačních podmínek jsme získali krystaly CaNce103p pro sběr difrakčních dat, ze kterých byla posléze vyřešena struktura CaNce103p v rozlišení 2.2 Å.  

Nukleasy jsou enzymy patřící do skupiny hydrolas, které hrají zásadní roli v procesech regulace genové exprese. Některé rostlinné nukleasy jsou zkoumané i z pohledu jejich cytotoxického účinku na nádorové buňky. V této práci se zabývám nukleasou TBN1 (Tomato bifunctional nuclease 1), což je glykoprotein o molekulové hmotnosti 37 kDa. Pro produkci rekombinantní nukleasy TBN1 byl navržen nový způsob exprese v suspenzní kultuře tabáku Nicotiana tabacum kultivar Bright Yellow 2 (BY-2). Při izolaci TBN1 ale dochází k její degradaci. Cílem mé práce je proto zlepšit stabilitu nukleasy TBN1 v produkčních buňkách a následně se pokusit nukleasu TBN1 purifikovat. Byla navržena dvě možná řešení dané problematiky. Prvním je purifikace nukleasy TBN1 metodou bezvakuolové izolace z již připravených suspenzních buněk BY-2/eGFP‑TBN1. Odstraněním vakuoly z buňky před izolací nukleasy by mělo být zamezeno uvolnění proteolytických enzymů a degradaci nukleasy TBN1. Druhou možností řešení by mohla být produkce nukleasy TBN1 ve fúzi s „ochranným proteinem“ – hydrofobinem. Proto byl připraven vektor obsahující gen pro TBN1 ve fúzi s hydrofobinem, následně bude tento vektor vnesen do bakterie Agrobacterium tumefaciens a pomocí této bakterie do BY-2 buněk.  

Zvýšená teplota představuje pro buňky nebezpečí v podobě denaturace proteinů a jejich následné ztrátě funkce vedoucí až k buněčné smrti. Proto buňky vyvinuly řadu mechanismů, jak ochránit svoje důležité struktury i během teplotního stresu. Jedním z těchto způsobů je vytvoření tzv. stresových granulí, což jsou transientní ribonukleoproteinové agregáty. Vytvořením těchto granulí dochází k zastavení translace a tím ke konzervaci energie pro další procesy a zároveň také k ochraně struktur důležitých nejen pro samotný proces translace. Po návratu do normálních nestresových podmínek je pro buňku nezbytné stresové granule rozpustit, aby mohlo dojít k obnovení translace a dalšímu růstu. Nerozpuštění těchto proteinových agregátů představuje pro buňku problém, jenž zásadním způsobem ovlivňuje její správné fungování.   Tato práce se zabývá vlivem fosfolipasy C na rozpouštění a formování teplem indukovaných stresových granulí v kvasince Sacharomyces cerevisiae.     

Mnohonásobná lieková rezistencia v somatických bunkách a mikroorganizmoch je v súčasnosti jedným z narastajúcich problémov medicíny. S týmto fenoménom je spojený molekulárny mechanizmus zvýšenej expresie P-glykoproteínu (P-gp). P-gp predstavuje transmembránovú efluxnú pumpu, ktorej úloha spočíva v exporte látky z bunky do vonkajšieho prostredia. Zvýšená expresia P-gp v nádorových bunkách má za následok zníženú akumuláciu liečiva. Preto je dôležité profilovanie nových zlučenín, ktoré by boli účinné a predstavovali by minimálnu mieru toxicity. Jednou z možností je využitie účinkov 27 flavonolignanov. Výsledky testov potvrdili, že sa jedná o silné antioxidanty a protizápalové zlučeniny vykazujúce inhibičnú aktivitu voči proteínom asociovanými s rezistenciou. Látky interagujúce s P-gp mȏzu jeho aktivitu stimulovať alebo inhibovať, na základe čoho dochádza k nárastu alebo poklesu ATPázovej aktivity. Schopnosť skúmaných látok inhibovať transportnú aktivitu P-gp bola meraniami preukázaná. Biologická aktivita flavonolignanov bola sledovaná z pohľadu ich cytotoxicity a vplyvu na proliferáciu buniek. Ďalšie merania sa budú zameriavať na testovanie vybraných zlučenín na nádorovej bunkovej línii karcinómu vaječníkov a jej sublínie rezistentnej na adriamycín.

Plant cell cultures are emerging as an alternative to mammalian cell cultures as expression platforms for the production of recombinant proteins containing posttranslation modifications. Some of the advantages of plant cell cultures over other expression systems are their rapid growth, intrinsic safety, low cost and the possibility of producing proteins that require posttranslational modifications such as glycosylation. Despite these advantages, one of the main challenges is achieving adequate accumulation levels of recombinant proteins in the plant cells along with efficient purification methods. One approach to address this issue has been to use protein-stabilizing fusion partners that help enhance recombinant protein accumulation through the formation of stable protein bodies. The aim of this project is to study the effect of Caleosin, a Ca(2+)-binding oil-body surface protein, as a fusion tag for recombinant protein production. In this work, the coding sequence for Caleosin was fused to enhanced Green Fluorescent Protein (eGFP) and expressed in tobacco bright yellow 2 (BY-2) cells by infiltration with Agrobacterium tumefaciens. The accumulation and localization of Caleosin-eGFP compared to free eGFP will be studied.  

Rutinosidasa (α-L-rhamnosyl-β-D-glukosidasa, EC 3.2.1.168) je diglykosidasa, která hydrolyzuje rutinosidy. Tento enzym byl izolován z různých mikrobiálních zdrojů: bakterie, plísně, kvasinky i archebakterie, avšak je stále málo prozkoumán a počet charakterizovaných rutinosidas je celkově nízký. Tyto enzymy mají značný biotechnologický potenciál. Vedle hydrolytické aktivity, která je využitelná v potravinářském a kosmetickém průmyslu, byla u některých izolovaných rutinosidas (především fungálních) pozorována i významná transglykosylační aktivita. Při transglykosylaci je odštěpený disacharid (rutinosa) přenášen na nový aglykon, a tak se tvoří nový rutinosid. Tyto biotransformace lze využít v potravinářském, biomedicínském a kosmetickém průmyslu. Rutinosidasy mají velký biotechnologický potenciál, avšak jejich přirození producenti jsou nároční na kultivaci a neprodukují dostatečné množství enzymu. Proto se zabýváme přípravou rekombinantních rutinosidas v heterologních expresních systémech, jako je Komagataella pastoris. Cílem práce je heterologní exprese vybraných fungálních rutinosidas, ověření jejich aktivity, izolace a následná charakterizace získaných enzymů. Kromě hydrolytických aktivit byly také testovány transglykosylační schopnosti s různými akceptory.