Studentská vědecká konference

Trojrozměrné struktury, které můžeme získat experimentálně, poskytují pouze částečný náhled na danou biomolekulu. Molekulární simulace nám však umožňují zkoumat samotnou dynamiku makromolekul. Simulace jsou ale stále moc pomalé a je těžké v nich zachytit konformační změny. Proto se snažíme vymýšlet nové metody. Hlavní metodou používanou v této práci je metoda létajících Gaussiánů vyvinuta v návaznosti na metadynamiku v naší laboratoři; další využívanou metodou je právě metadynamika. U většiny simulačních metod je nutné využívat kolektivní proměnné (parametry, které dobře charakterizují daný systém). U metody létajících Gaussiánů však tyto parametry používat nemusíme a potenciálně můžeme zkoumat i systémy, kde výběr kolektivních proměnných není triviální. Metoda létajících Gaussiánů byla úspěšně otestována na malých modelových systémech a bude využita ke zkoumání konformačního prostoru malých peptidů. Jako základní peptid využívám acetylalanin-N-methylamid, jeho deriváty a uměle navržený dekapeptid chignolin. Porovnání ploch volné energie současných výsledků naznačuje, že metoda létajících Gaussiánů je v urychlování efektivnější než metadynamika. V současnosti se snažíme o nalezení metody, která by dokázala reprezentovat konformační prostor bez znalosti kolektivních proměnných.

Umělé neuronové sítě byly původně navrženy jako nástroj pro modelování a studium nervové soustavy. Kvůli schopnosti se učit jsou často užívané v umělé inteligenci, jako praktické nástroje pro řešení vědeckých a inženýrských problémů. Jednou z takovýchto sítí je Char-RNN, kterou můžeme použít pro generování sekvencí proteinů na základě sekvencí reálných proteinů.  Mým úkolem bylo u takto navržených proteinů předpovědět sekundární strukturu. Vybrané sekvence pak zkrátit na 30-50 AMK a předpovědět jejich 3D strukturu. Pro tyto účely byly připraveny “fragment libraries”, pomocí nichž bylo vygenerováno více modelů prostorových struktur vybraných peptidů se zadanou sekvencí a pro každý model bylo vypočítáno skóre, popisující kvalitu modelů.  Pro sekvenci, která vykazovala přítomnost “sbalovací nálevky”, byl navržen a připraven syntetický gen, který byl ověřen sekvenováním. Následně byl exprimován v buňkách E. coli BL21(DE3). Buňky byly dezintegrovány a požadovaný protein byl přečištěn pomocí afinitní chromatografie.  Sekundární struktura peptidu byla charakterizována metodou cirkulárního dichroismu. Dle předpokladu měl peptid obsahovat přibližně 70 % a-helixů, ale ve skutečnosti peptid obsahoval pouze 9 % a-helixů. V současnosti probíhá příprava dalšího peptidu.

Obezita je v dnešní době závažný zdravotní problém. Nové možnosti ve vývoji budoucích léků proti obezitě a diabetu představují anorexigenní neuropeptidy, které se tvoří v mozku a působí na snížení příjmu potravy a tělesné hmotnosti. Tato práce se zabývá lineárními anorexigenními neuropeptidy, peptidem uvolňujícím prolaktin (PrRP) a neuropeptidem FF (NPFF), které se řadí do skupiny tzv. RF-amid-peptidů. Typickým znakem RF-amid-peptidů je zakončení C-konce sekvencí Arg-Phe-NH₂, která je nezbytná pro vazbu na jejich receptory. Bylo zjištěno, že PrRP se váže na svůj přirozený receptor GPR10 a zároveň vykazuje vysokou afinitu k receptoru pro neuropeptid FF (NPFF2). Ve své práci se zabývám vybranými lipidovanými peptidovými analogy PrRP a jejich mechanismem účinku in vitro. Lipidizace analogů PrRP navržených v laboratoři skupiny RNDr. Lenky Maletínské, CSc. umožňuje vyvolání centrálního anorexigenního účinku po periferním podání, a tím nabízí možnost potenciálního terapeutického využití. Cílem je zmapovat signalizace těchto peptidů do buňky na buněčných liniích s exprimovaným receptorem GPR10 nebo s receptory s částečnou homologií ke GPR10 receptoru.  

Nové syntetické drogy jsou problémem současné drogové scény. Bývají navrženy jako analoga nelegálních drog za účelem obejít stávající legislativu. Jejich výrobci se snaží připravit takovou psychoaktivní substanci, která dosud není na seznamu ilegálních látek, nebo jejíž prekursory nejsou monitorovanými látkami. Detekce nových syntetických drog je velmi obtížná. Imunochemické techniky zaměřené na klasické drogy nejsou schopny většinu nových látek prokázat, protože i malá změna struktury může způsobit falešně negativní výsledek testu. Jednou z možností, jak nově syntetizované drogy zjistit je zavedení metody TANGO. Metoda TANGO je založena na principu přepisu reportérového genu pro luciferasu, který je aktivován fúzí testované látky s cílovým receptorem. Tím často bývá receptor spřažený s G-proteiny. Mým úkolem bylo zavést tuto metodu pro serotoninové receptory HTR2, které jsou cílem působení mnohých psychoaktivních drog. Pomocí této metody můžeme s jistotou určit, zda neznámá substance se serotoninovým receptorem interaguje a tudíž vykazuje psychoaktivní účinky. Cílem této práce je příprava buněčné linie produkující serotoninové  receptory se systémem TANGO, na které bude možné testovat deriváty nových syntetických drog.  

Cancer stem cells (CSCs), a small population of cells within the tumour characterized with self-renewal capacity and ability to give rise to a tumour in the immunocompromised mice, are believed to be the main reason for the failure of cancer treatment. CSCs are characterized by higher expression of ATP-binding cassette (ABC) transporters, which pump chemotherapeutics and various endogenous substrates across the membranes. Mitochondria are essential cellular organelles containing enzymes participating in important biological processes. There are four known mitochondrial ABC transporters: ABCB6, ABCB7, ABCB8 and ABCB10. They have exclusive function in mitochondrial processes related to iron metabolism such as iron-sulphur cluster biogenesis (ABCB7), heme biosynthesis (ABCB10, ABCB6) or mitochondrial iron export (ABCB8). These transporters are also  implicated in protection against reactive oxygen species and chemoresistance. We found differential expression of these transporters in CSCs derived from breast cancer cell lines on mRNA and also on protein level. In particular, ABCB8 was upregulated while ABCB10 was downregulated in our CSC model. Therefore, the focus of this project is to study their cellular function and their role in cancer stem cell maintenance and biology.

Receptory spřažené s G proteiny (GPCR) a heterotrimerní G proteiny hrají významnou roli v buněčné signalizaci. G-proteinová signalizace je důležitá pro kardiovaskulární funkci, neurotransmisi a další procesy. G-proteinová signalizace je proto cílem mnoha léčiv, a znalost molekulárních aspektů G-proteinové signalizace je tudíž důležitá jak pro vědecké poznání, tak pro farmaceutické aplikace. Cílem práce je zjistit s využitím techniky dvoufotonové polarizační mikroskopie (2PPM), zda stimulační G-proteinová podjednotka Gαs v živých buňkách fyzicky interaguje se zástupci GPCR již před aktivací příslušného receptoru. Technika 2PPM sleduje tzv. lineární dichroismus (LD), tj. poměr mezi intenzitami fluorescence emitované po ozáření vzorku horizontálně a vertikálně polarizovaným světlem. LD závisí na orientaci fluoroforu, na niž mají často vliv interakce mezi proteiny. Technikou 2PPM jsme schopni citlivě sledovat interakce mezi GPCR a inhibiční podjednotkou Gαi1. Naše pozorování interakcí GPCR se stimulační podjednotkou Gαs za využití existujících konstruktů však zatím neposkytla jednoznačné výsledky. V současnosti probíhá příprava modifikovaných konstruktů na bázi podjednotky Gαs a další mikroskopická pozorování.  

Jednou ze světově nejrozšířenějších civilizačních chorob je obezita, která je úzce spjata s nadměrným příjmem potravy a minimálním energetickým výdejem. Neustále rostoucí výskyt obezity představuje závažná rizika spojená s dalšími zdravotními komplikacemi. Jednou z potenciálních možností léčby mohou být centrální anorexigenní neuropeptidy. Farmakologickou otázkou je však přestup neuropeptidů z periferie přes hematoencefalickou bariéru. Po periferním podání tyto látky nejsou schopné projít do mozku a vyvolat zde biologickou odezvu. Ve své práci se věnuji peptidu uvolňující prolaktin (PrRP) a jeho analogům. PrRP patří do rodiny RF-amidových peptidů a po centrálním podání snižuje příjem potravy. Připojením mastné kyseliny je PrRP schopen způsobit anorexigenní účinek i při periferním podání. PrRP se váže na receptor GPR10 a vykazuje afinitu i k receptoru pro neuropeptid FF (NPFF2). Fyziologicky se vyskytuje ve dvou isoformách (PrRP31 a PrRP20) a pro vazbu na receptor je nejdůležitější jeho C-koncová sekvence. Nejkratší fragment se zachovanou vysokou afinitou k receptoru je PrRP13. V naší laboratoři byly syntetizovány analogy PrRP13, které jsou v rámci této práce podrobeny vazebným a funkčním testům a je zjišťován jejich potenciální agonistický či antagonistický účinek.

S růstem výroby kovových nanočástic vzrostl i jejich obsah v okolním prostředí, kde rychle a snadno pronikají do jakéhokoliv organismu nebo znečišťují životní prostředí. Nanočástice, zejména do 50 nm, procházejí biologickými bariérami a interagují s mnoha intracelulárními strukturami – například inhibují enzymy, narušují vodivost membrány, vážou se na proteiny. A mohou nakonec způsobit i buněčnou smrt. Cytoskelet funguje jako určitý senzor změn v okolí buňky a odchylky v jeho dynamice mohou nastartovat celou kaskádu dějů, které buňce pomohou vyrovnat se s nepříznivými podmínkami. Pokusili jsme se zjistit, jak nanočástice ovlivňují dynamiku mikrotubulárního cytoskeletu a jeho schopnost k regenerace v různých intervalech po ošetření kovovými nanočásticemi.