Studentská vědecká konference

Survivin is a potential oncotheraupeutic marker which is upregulated in most cancer cells. It was shown that the cellular localization and function of survivin are directly connected with the acetylation of lysine 129 by CREB-binding protein and its decetylation by histone deacytylase 6 (HDAC6). Deacetylation of survivin by HDAC6 leads to its nuclear export to the cytoplasm, where it blocks the programmed cell death by inactivating caspase proteins, thus providing a survival advantage for cancer cells. To understand the nature of this deacetylation reaction, we specifically incorporated acetylated lysine into survivin at position 129 using an orthogonal translation machinery. Further studies will be focused on the detailed characterization of survivin deacetylation by HDAC6.  

Fukosidasy jsou enzymy ze třídy hydrolas, které mají v živých organismech důležitou roli zejména při imunitní odpovědi, oplodnění a vývoji vajíčka, ale také například při nádorových onemocněních. Některé fukosidasy dokáží za vhodných podmínek in vitro katalyzovat kromě hydrolýzy glykosidové vazby také transglykosylaci, tedy syntézu nové vazby, což je zajímavé zejména pro farmaceutický průmysl. V této práci se zabývám přípravou transfukosidas z α-L-fukosidasy iso2 z Paenibacillus thiaminolyticus. Cílem je zvýšit transglykosylační aktivitu α-L-fukosidasy pomocí randomní i cílené mutageneze. Náhodné mutanty byly připravovány s využitím metody error-prone PCR. Zde byly nejprve testovány mutagenní podmínky a u získaných mutantů byla následně porovnávána specifická aktivita s nemutovaným enzymem. Mezi získanými mutanty však nebyly prozatím nalezeny žádné potenciální transfukosidasy. Během letošního roku byla také vyřešena 3D struktura tohoto enzymu. Cílenou mutagenezí byly nejprve identifikovány katalytické aminokyseliny a následně byly vytipovány i aminokyseliny, které by mohly mít vliv na transglykosylační aktivitu enzymu. Záměnou vybraných aminokyselin budou připraveny a produkovány mutanty, u kterých bude charakterizována jejich transglykosylační aktivita.

Nikotinamidfosforibosyltransferasa (Nampt) je protein s širokou škálou účinků. V organismu působí jako enzym a patrně také jako cytokin a adipokin. Nampt hraje klíčovou úlohu v biosyntéze NAD z nikotinamidu, kde katalyzuje přenos fosforibosylového zbytku z 5-fosforibosyl-1-pyrofosfátu na nikotinamid za vzniku nikotinamidmononukleotidu. Naším dlouhodobým cílem je zjistit, zda Nampt funguje jako cytokin či adipokin, bez ohledu na enzymovou aktivitu. Za účelem vyřazení aktivity byly připraveny klony hepatocytů HepG2 s jednou, dvěma či třemi substitucemi aminokyselin v aktivním místě Nampt. V rámci této práce jsme charakterizovali klony. Stanovením rychlosti biosyntézy NAD z nikotinamidu byla nepřímo stanovena enzymová aktivita Nampt. Ve srovnání s kontrolními buňkami měly klony s jednou substitucí zvýšenou rychlost syntézy NAD, klony s více substitucemi měly rychlost podobnou jako kontrolní buňky. Shodné výsledky byly získány stanovením intracelulárního množství NAD pomocí hmotnostní spektrometrie. Buňky byly také ovlivněny inhibitorem aktivity Nampt FK866. Klony s jednou substitucí byly odolnější vůči působení FK866 než klony s více substitucemi. Výsledky ukazují, že pro další výzkum jsou vhodné klony s produkcí Nampt, které mají více substitucí aminokyselin v aktivním místě.  

Krevnička střevní (Schistosoma mansoni) patří mezi parazitické motolice způsobující onemocnění schistosomózu. Toto závažné onemocnění postihuje přes dvě stě miliónů lidí převážně v tropických a subtropických oblastech. Dospělé krevničky žijí v cévním systému hostitele a živí se jeho krví. Pro životaschopnost krevničky jsou nezbytné proteolytické enzymy (proteasy). Proteasy se podílejí na interakcích parazita s hostitelem – např. na invazi do hostitele, modulaci homeostáze hostitele, či trávení krevních proteinů hostitele, které slouží jako hlavní zdroj živin parazita. Tato práce se zabývá katepsinem B2 (SmCB2), cysteinovou proteasou z krevničky střevní, jejíž biologická role dosud není známá. Cílem práce je příprava rekombinantní formy SmCB2 a její biochemická charakterizace. Pro rekombinantní produkci proteinu byl konstruován expresní systém v kvasince Pichia pastoris. SmCB2 byl kvasinkami produkován do média, ze kterého byl následně izolován pomocí chromatografických metod. Zahájena byla proteomická charakterizace připraveného proteinu.  

Schistosomóza je onemocnění způsobované parazitickými motolicemi, krevničkami rodu Schistosoma. Světová zdravotnická organizace WHO uvádí schistosomózu postihující více než 200 mil. lidí jako jedno z nejzávažnějších parazitárních onemocnění. Dospělci krevniček žijí v krevním řečišti lidského hostitele, kde se živí převážně hemoglobinem. K trávení hemoglobinu ve střevě parazita je používán proteolytický systém enzymů, jehož součástí je katepsin C (dipeptidylaminopeptidasa 1, DPAP1). Vzhledem k důležité roli při výživě parazita je DPAP1 perspektivní cílovou molekulou pro terapeutický zásah. V současné době není známa 3D struktura DPAP1, která by umožňovala racionální vývoj inhibitorů tohoto enzymu jako potenciálních léčiv proti schistosomóze. Tato práce je zaměřena na přípravu a úvodní biochemickou charakterizaci rekombinantní formy DPAP1 z krevničky Schistosoma mansoni. K tomuto účelu byl připraven expresní systém v prvokovi Leishmania tarentolae pro produkci DPAP1, která byla stabilizována bodovou mutací v aktivním místě. DPAP1 byl akumulován v kultivačním médiu, ze kterého byl izolován chromatografickými metodami a byla zahájena jeho analýza proteomickými technikami.  

Nespecifická fosfolipasa C (NPC) je enzym patřící mezi rostlinné fosfolipasy. Produkty reakcí, které katalyzují, mají významnou signální i metabolickou funkci. V genomu Arabidopsis thaliana bylo identifikováno šest genů kódujících NPC (NPC1-NPC6). V současnosti je u všech šesti NPC popsána jak jejich aktivita, tak i fyziologická funkce. V rámci předchozích experimentů s NPC4 bylo zjištěno, že aktivitou tohoto enzymu in vitro vzniká kromě diacylglycerolu také kyselina fosfatidová. To by ukazovalo na PLC i PLD aktivitu této NPC. Cílem této práce je studovat vliv mutací v okolí aktivního místa na katalytickou aktivitu a specifitu. Na základě vytvořených strukturních modelů a literatury byly vybrány aminokyseliny aktivního místa. Modifikované enzymy byly produkovány v kmenu Arctic Express E. coli a afinitně purifikovány pomocí metody IMAC. Stanovení aktivity enzymů probíhá kvalitativně pomocí TLC a fluorescenčně značeného substrátu. Pro kvantitativní stanovení byl navrhnut postup spektrofotometrického stanovení produktů fosfocholinu a cholinu s využitím spřažených reakcí využívajících reakce peroxidu vodíku s chromogenním substrátem.

Chladově aktivní enzymy jsou produkovány skupinami mikroorganismů, nazývaných psychrofily a psychrotrofy, přizpůsobených životu na chladných stanovištích. Tyto enzymy si uchovávají vysokou specifickou aktivitu při nízkých teplotách, což přináší možnost jejich využití v biotechnologickém průmyslu. Tato práce se zabývá hledáním genu pro chladově aktivní chitinasy a celulasy v genomu antarktické bakterie Arthrobacter sp. C1-1. S využitím webových databází UniProt a GenBank byly získány sekvence genů kódujících chitinasy z fylogeneticky nejpříbuznějších zástupců rodu Arthrobacter. Pomocí nástroje Clustal Omega byly tyto sekvence zarovnány a dle nalezených konzervativních oblastí byly navrženy genově specifické primery, které sloužily pro amplifikaci části genu. Templátem pro amplifikaci hledaného úseku genu pomocí PCR byla genomová DNA. Získaný úsek DNA byl sekvenován a následné ověření správnosti nalezeného úseku bylo provedeno pomocí webového nástroje BLAST. Porovnáním bylo předpovězeno, že se jedná o část genu pro chitinasu. Zbytek genu byl získán metodou „primer walking“. Gen byl vložen do plasmidu pET 22b, kterým byly transformovány buňky E. coli BL21(DE3), v nichž byla testována jeho exprese. Produkovaný protein bude dále purifikován a posléze charakterizován.