Studentská vědecká konference

Práce je zaměřena na porovnání metod a buněčných modelů pro studium osteodiferenciace, které budou v budoucnu využity pro studium nových biomateriálů pro ortopedické aplikace. Byly použity 2 buněčné modely: buněčná osteosarkomatická linie SaOS-2 a imortalizované kmenové buňky hTERT-ASC. Pro indukci osteodiferenciace bylo použito osteodiferenciační médium komerční (neznámé složení) a námi připravené. Po kultivaci 7 a 14 byla sledována osteodiferenciace barvením depotu Ca²⁺ Alizarinovou červení (ARS), stanovením aktivity alkalické fosfatasy (ALP) a imunochemicky - byl stanoven protein osteopontin (OPN). U buněčné linie SaOS-2 po 14 dnech u ARS byla mikroskopicky i kvantitativně prokázána zvýšená depozice Ca (až 14krát oproti kontrole) a aktivita ALP byla také signifikantně zvýšená. U buněk hTERT zatím nebylo ani v jednom typu média dosaženo dostatečné odpovědi jak u ALP (aktivita cca 300krát nižší než u SaOS-2), tak u ARS (téměř 50krát nižší odezva). Jako nejlepší metoda pro sledování osteodiferenciace se jeví ARS, ale ARS nebude možné použít na hydroxyapatitových materiálech. Proto je nutné optimalizovat metodu ALP. Do budoucna je v plánu imunofluorescenční mikroskopie a imunochemické stanovení proteinů (kolagen a ALP).

Katepsin V je cysteinová proteasa s vysokou elastinolytickou aktivitou, která je specificky exprimována v několika typech nádorové tkáně. Představuje potenciální diagnostický marker a cílovou molekulu pro vývoj protinádorových léčiv. Tato práce je zaměřena na přípravu rekombinantního katepsinu V v dostatečném množství a čistotě. K produkci byl využit expresní systém v kvasince Pichia pastoris, kde byl katepsin V produkován jednak ve formě aktivního enzymu a jednak jako neaktivní mutant. Rekombinantní protein byl purifikován pomocí gelové permeační a ionexové chromatografie. Připravená aktivní forma enzymu je používána při analýze nových inhibitorů na bázi vinylsulfonů v kinetickém aktivitním testu s fluorogenním substrátem. Mutantní forma katepsinu V bude využita pro strukturní krystalografickou analýzu.

Myelodysplastický syndrom (MDS) je onemocnění krvetvorby charakterizované nedozráváním kmenových buněk, či dysplazií. Cílem práce bylo vytvořit nástroj pro výzkum a diagnostiku tohoto onemocnění v plazmě s využitím optické metody SPR (Surface Plazmon Rezonance), která se využívá k charakterizaci biomolekulárních interakcí. Pomocí vazebné a afinitní konstanty umožňuje zjistit množství vázajícího proteinu a jeho stabilitu. Místo interakčních partnerů pro markery MDS byly na SPR čip imobilizovány frakce zdravé plazmy. Tyto frakce byly připraveny třemi způsoby: gelovou chromatografií, deplecí s následnou gelovou chromatografií a pomocí ProteoMineru s následnou gelovou chromatografií. Metoda SPR měla dvě hlavní části: imobilizace frakcí normální plazmy na čip a samotná detekce protein-protein interakcí. Analyzovali jsme vzorky MDS pacientů a zdravé kontroly. Jako nejvhodnější způsob přípravy frakcí plazmy pro SPR se jeví samotná gelová chromatografie a varianta deplece – gelová chromatografie. V pilotních experimentech byly zjištěny rozdíly v interakcích imobilizovaných frakcí plazmy se vzorky plazmy pacientů v různých stadiích MDS a se vzorky plazmy zdravých dárců. Získaná data budou využita k profilování MDS pacientů pomocí SPR imagingu, kdy lze analyzovat více vzorků souběžně.

Visfatin je popisovaný ako enzým zúčastňujúci sa syntézy NAD z nikotínamidu, kde katalyzuje prenos fosforibosylovej skupiny z 5-fosforibosyl-1-pyrofosfátu na nikotínamid za vzniku nikotínamidmononukleotidu a pyrofosfátu. Presný mechanizmus tejto reakcie ale nebol dosiaľ objasnený. Predpokladá sa, že pre priebeh enzýmovej katalýzy visfatinu je nevyhnutná autofosforylácia histidínu na 247. pozícii. Našim cieľom bolo tento predpoklad overiť. Boli pripravené bunky HepG2 s produkciou visfatinu v prirodzenej forme (WT) a visfatinu s bodovou mutáciou H247A. Každá z foriem bola pripravená s pripojenou polyhistidínovou kotvou i bez nej. Nasledovalo meranie enzýmovej aktivity visfatinu v bunkovom lyzáte pomocou fluorescenčnej detekcie vznikajúceho NAD ako konečného produktu celej biosyntetickej dráhy z nikotínamidu. V porovnaní s kontrolou vykazoval visfatin-WT-HisTag aj visfatin-WT bez pripojenej histídinovej kotvy rovnako zvýšenú enzýmovú aktivitu, čím bol vylúčený vplyv histidínovej kotvy. Ich hodnoty enzymových aktivít sa však tiež zhodovali s aktivitami visfatinu-H247A a visfatinu-H247A-HisTag. Tým sa ukázalo, že visfatin s bodovou mutáciou H247A má zachovanú svoju enzýmovú aktivitu. Tieto výsledky naznačujú, že autofosforylácia nie je esenciálna pre enzýmovú katalýzu visfatinu.

Stárnoucí populace se stále častěji potýká se zdravotními problémy způsobenými zlomeninami, následky osteopórozy či jinými kostními defekty. Biomateriály třetí generace jsou vhodnou alternativou k jejich léčbě, jelikož jsou schopné vyvolání specifické odpovědi na molekulární úrovni v podobě stimulace migrace, proliferace a především diferenciace mezenchymálních kmenových buněk (MSC) na zralé osteoblasty. Tato práce se nejprve zaměřuje na sledování samotné osteodiferenciace indukované osteodiferenciačním médiem. Testovanou kulturou jsou imortalizované MSC, od kterých se očekává, že po stimulaci tímto médiem budou exprimovat řadu specifických genů. Mezi těmi byl vybrán kolagen typu I, osteokalcin, osteopontin, alkalická fosfatasa a transkripční faktor Runx2. Sledováním relativní míry transkripce těchto osteodiferenciačních markerů pomocí kvantitativní PCR s reverzní transkripcí lze poté potvrdit, zdali k osteodiferenciaci skutečně dochází. Stěžejním krokem je výběr vhodných referenčních genů, ze kterých postoupí do užšího výběru minimálně dva až tři s nejstabilnější expresí. Těmi je prozatím TATA vazebný protein, 14-3-3 protein zeta/delta a β-glukuronidasa. V budoucnu by se práce měla zaměřit na testování osteoindukčního potenciálu nanostrukturovaných titanových materiálů.

Tato práce se zabývá, jak zhoubným onemocněním, tak leukemií. Při zhoubných onemocněních včetně leukemií mění rakovinné buňky svůj metabolismus tak, aby podporoval růst, přežívání a proliferaci. Společným znakem pozměněného metabolismu je zvýšená spotřeba glukózy, její přeměna na laktát a snížená oxidační fosforylace i za přítomnosti plně funkčních mitochondrií. Tento efekt se nazývá aerobní glykolýza (Warburgův efekt). Savčí buňky katabolizují hlavně glukózu a glutamin, a proto jsou s nimi související metabolity sledovány i při onkohematologických onemocněních. Změněný metabolizmus doprovází rovněž oxidační stres, který je často charakterizován plazmatickou koncentrací malondialdehydu (MDA). Pro sledování metabolitů citrátového cyklu a volných aminokyselin v plazmě jsme použili kapalinovou chromatografii s hybridním hmotnostním spektrometrem QTRAP 4000 (Amedis, Praha). Pro oba typy metabolitů byly testovány různé kolony. Pro metabolity citrátového cyklu se zatím nejvíce osvědčila kolona Xbridge Amide (Waters, Praha), pro aminokyseliny to byla kolona Zic-Hilic (Merck, Praha). Pomocí uvedených metod budou stanoveny koncentrace metabolitů citrátového cyklu, aminokyseliny a MDA v plazmě pacientů s onkohematologickými malignitami a v plazmě kontrolní skupiny zdravých dárců.

Dlaždicobuněčný karcinom hlavy a krku je v ČR podle údajů ČSÚ příčinou zhruba 800 umrtí ročně, což představuje přibližně 3% všech úmrtí na rakovinu. V našem souboru máme 18 pacientů s tímto onemocněním, u nichž byla sekvenována DNA z normální a nádorové tkáně, s cílem nalézt mutace, které vedly k rozvoji onemocnění. DNA sekvenování nové generace je v současnosti již dobře zavedenou procedurou a pro zpracování sekvenačních dat existuje řada standardních nástrojů. Přesto vlastní analýza není triviální záležitostí. Už jen velikost zpracovávaných dat obvykle přesahuje možnosti běžných počítačů. Proto jsme se rozhodli postup vyzkoušet nejprve na publikovaném datasetu s verifikovanými výsledky. Výstupní data ze sekvenátoru jsme v několika krocích očistili a srovnali s referenčním genomem. U jednotlivých pacientů jsme pak porovnali nádorové vzorky vůči normálním, nenádorovým. Analýzu jsme provedli za pomoci dostupných bioinformatických nástojů a vlastních striptů v programovém prostředí R. Tímto postupem se podařilo replikovat publikované výsledky a identifikovat popsanou mutaci. Můžeme ho tedy v další fázi použít pro naše data.

Interferony lambda (IFNL) řadíme mezi signální molekuly imunitního systému. K jejich expresi dochází pouze v epitelových buňkách v důsledku virové infekce. Sekretované interferony se váží na heterodimerní membránový receptor složený z podjednotek IFNLR1 a IL-10R2. Navázání interferonu spouští JAK-STAT signální dráhu, která vede k aktivaci transkripce interferon senzitivních genů. IFNL1 až 3 tímto mechanismem stimulují protivirovou odpověď. IFNL4 rovněž aktivuje JAK-STAT dráhu stejně jako IFNL1-3, avšak současně brání spontánní eliminaci viru hepatitidy C. Tento paradox společně s dalšími odlišnostmi, jako je například nižší extracelulární sekrece IFNL4 v porovnání s ostatními IFNL, vyvolává úvahy o možném působení IFNL4 jako intracelulární signální molekuly. Za účelem studia těchto zatím neznámých hypotetických nekanonických signálních drah IFNL4 jsme pomocí metody editace genomu CRISPR/Cas9 vyvinuli buněčné linie deficitní pro IFNLR1. V deficitních i kontrolních liniích transfekovaných IFNL3 nebo IFNL4 jsme u buněk transfekovaných IFNL4 pozorovali jadernou lokalizaci IFNL4. Jaderná lokalizace IFNL3 u IFNL3 transfekovaných buněk nebyla detekovatelná.

Esenciální aminokyselina tryptofan může být v lidském těle metabolizována několika cestami. Hlavní cestou degradace je tzv. kynureninová cesta. Při určitých patofyziologických stavech je v extrahepatálních buňkách první oxidační krok vedoucí ke vzniku formylkynureninu katalyzován indolamin-pyrrol-2,3-dioxygenasou. Zvýšená koncentrace kynureninů je spojována s rizikem vzniku akutních koronárních syndromů, jako jsou nestabilní angina pectoris, akutní infarkt myokardu a další. Tato onemocnění jsou provázena oxidačním stresem, který je často charakterizován stanovením malondialdehydu (MDA) v krevní plasmě. Ke stanovení metabolitů tryptofanu v plasmě zdravých dárců jsme použili HPLC s detekcí pomocí tandemového hmotnostního spektrometru pracujícího v režimu sledování vybraných reakcí. Bylo testováno několik kolon, kdy nejlepší výsledky poskytovala kolona Atlantis T3 (Waters, Česká republika). Pro přímé stanovení MDA jsme navrhli HPLC metodu s využitím kolony Zic-Hilic (Merck, Česká republika), kterou porovnáme s HPLC metodou využívající derivatizaci MDA 2,4-dinitrofenylhydrazinem. Pomocí uvedených metod budou stanoveny koncentrace tryptofanových metabolitů a MDA v plasmě pacientů s kardiovaskulárním onemocněním a v plasmě kontrolní skupiny zdravých dárců.