Studentská vědecká konference

Cirhóza jater je závažné onemocnění charakterizované ztrátou funkce jater a významným zvýšením rizika vzniku hepatocelulárního karcinomu. V dnešní době je cirhóza a hepatocelulární karcinom příčinou 3,5 % všech celosvětových úmrtí. Tato onemocnění často zůstávají asymptomatická až do pokročilých stadií, což komplikuje jejich diagnostiku a léčbu. K jejich diagnostice jsou používány nespecifické krevní biomarkery, některé zobrazovací techniky jako počítačová tomografie a magnetická rezonance nebo invasivní biopsie jater. Cílem práce je nalezení a sestavení specifických panelů proteinových biomarkerů v krevní plazmě, které umožní rychlejší a přesnější diagnostiku zmíněných onemocnění a které povedou k účinnější léčbě a lepší prognóze pacientů. K rozlišení skupin pacientů s cirhózou a hepatocelulárním karcinomem byla využita hmotnostní spektrometrie MALDI-TOF, získaná spektra byla zpracována pomocí analýzy hlavních komponent a pro další zpracování a analýzu dat byl použit databázový systém PostgreSQL, ke kterému se přistupovalo pomocí nástroje pgAdmin. Tímto způsobem byly získány hodnoty m/z odlišující jednotlivé skupiny. V budoucnu je plánováno využít i hmotnostní spektrometrii LC-MS/MS, která spolu se statistickým zpracováním pomůže identifikovat potenciální proteinové biomarkery.

Proteomická analýza je obor zabývající se studiem proteomu s cílem získat podrobné informace o funkci, struktuře či vlastnostech biologických systémů.  Tato technika se stává stále populárnější v klinické medicíně, kde se využívá ke studiu patologických stavů či k nalezení biomarkerů. Nejčastěji zkoumanými vzorky při těchto analýzách jsou takové, které mají rozpustný charakter a jsou snadno dostupné neinvazivním odběrem (krev, sérum, moč). Tato práce je však zaměřená na vzorky s nerozpustnou matricí, mezi něž patří například kosti nebo oční rohovka, která byla během těchto experimentů zkoumána, stejně jako vzorky benigních kostních výrůstků (osteomy a exostózy). Problém nerozpustných vzorků je ten, že jejich příprava pro proteomické zpracování je náročná a zdlouhavá – proto využíváme metodu in-sample digestion, tedy metodu přímého štěpení trypsinem, která je založená na předpokladu, že molekuly trypsinu mají schopnost pronikat strukturou nerozpustné matrice a štěpit proteiny přímo uvnitř vzorku. Našimi experimenty se podařilo identifikovat přes 1000 proteinů ve zkoumaných vzorcích rohovky, 621 proteinů v osteomu a 532 celkových proteinů v exostózách. Cílem do budoucna je aplikovat tuto metodiku i na další nerozpustné vzorky a tím rozšířit možnosti využití v běžné klinické praxi.

Identifikácia zvieracieho pôvodu tepelne upravených zvieracích kostí je dôležitá napríklad v archeológii, keďže nám môže poskytnúť pohľad na minulé spôsoby života, kultúry a environmentálne podmienky, ale tiež je dôležitá vo forenzných vedách a v potravinárskom priemysle. A preto bolo cieľom tejto práce pomocí proteomické analýzy určiť živočíšny pôvod vybraných zvieracích kostí (jahňaťa, kravy, prasaťa a sliepky). Stehenné kosti týchto zvierat sa varili pri teplote 100 °C a piekli pri teplote 180 °C po dobu 2 hodín. K porovnaní sa použili kosti, ktoré neboli tepelne spracované. Vzorky sa najskôr demineralizovali (24 hodín) a následne sa štiepili trypsínom (4 hodiny). Na prečistenie vniknutých peptidov sa použila reverzná fáza ZipTip C18. K analýze sa využila metóda hmotnostnej spektrometrie MALDI-TOF. K vyhodnoteniu spektier bol použitý počítačový software mMass a následne sa pre spracovanie dát použil databázový systém PostgreSQL, ku ktorému sa pristupovalo pomocou nástroja pgAdmin. Týmto spôsobom sa získali charakteristické m/z hodnoty pre jednotlivé živočíšne druhy a rôznym spôsobom opracované kostí. V budúcnosti sa práca zameria na vzorky jeleňa, kačky a kozy a na určenie zvieracieho pôvodu kostí prostredníctvom hmotnostnej spektrometrie typu LC-ESI-Q-TOF.

Bezsérová kultivace je prostředkem k odstranění variabilních vlivů při experimentech prováděných na buněčných liniích – především rozdílnosti šarží běžně přidávaného hovězího fetálního séra (FBS) a jeho nedefinovaného složení. Taktéž vede ke zkvalitnění následné proteomické analýzy, jelikož je eliminována kontaminace hovězími sérovými proteiny. Zároveň je ale pro experimenty zásadní zachování fyziologických podmínek pro buňky, aby v důsledku záměny kultivačního média nedocházelo k nechtěnému zkreslení výsledků. Cílem našich experimentů bylo sledovat pomocí LC-MS/MS analýzy kvalitativní i kvantitativní změny v proteomu a sekretomu dvou osteoblastických buněčných linií kultivovaných ve třech variantách bezsérových médií s různými přídavky oproti kontrole, která obsahuje v médiu standardních 10 % FBS. U buněčné linie Saos-2 se nejvíce lišil proteom buněk kultivovaných pouze v základním médiu DMEM/F-12, zatímco u linie hFOB 1.19 se nejvíc odlišoval proteom kontrolních buněk (médium s 10 % FBS). Vzorky médií byly navíc precipitovány acetonem či přečištěny na reverzní fázi C4 ve snaze zvýšit počet identifikovaných lidských proteinů oproti vzorkům bez úpravy. Žádný z uvedených postupů ovšem ke zvýšení nevedl.

V současné době představuje nelegální obchod s ohroženými živočišnými druhy velký celospolečenský problém. Mnoho lidí je kvůli vidině výdělku ochotno obětovat i vymření některých zvířecích druhů, avšak i ztráta jediného má drtivý dopad na celé ekosystémy. Aby tomu bylo zabráněno, je veškerý obchod s živočišnými druhy monitorován patřičnými úřady. V případě záchytu podezřelého materiálu je nutné zjistit, zda náleží chráněnému druhu. K tomuto účelu slouží řada různých metod, kdy nejpoužívanější je analýza DNA, avšak i ta má svá omezení, protože je nutné analyzovat materiál s dostatečným množstvím nedegradované DNA, což nemusí být vždy možné. Elegantním řešením tohoto nedostatku jsou relativně stálé proteiny, které tvoří značnou část živočišných těl. Tato práce se zabývá analýzou kožních derivátů devíti živočišných druhů (dikobraza, hroznýše, kočky, koně, krajty, mravenečníka, prasete, psa a užovky) pomocí hmotnostní spektrometrie MALDI-TOF (matricí asistované laserové desorpce/ionizace ve spojení s analyzátorem doby letu). Touto metodou se podařilo získat charakteristické hodnoty m/z, které umožňují jednoznačně rozlišit jednotlivé živočišné druhy.  

Fosforylace serinu 10 histonu H3 zabraňuje kondenzaci chromatinu a umožňuje aktivní transkripci genů z rozvolněné DNA. U Drosophila malongaster většinu těchto fosforylací katalyzuje kinasa – JIL-1, která neobsahuje doménu vázající se na chromatin. Tuto funkci zastupuje protein JASPer, jenž rozpoznává specifické místo na histonu a po tvorbě stabilního komplexu s JIL-1 navede kinasu k nukleosomu. Lidský homolog proteinu JASPer, LEDGF/p75, má podobnou funkci, doménovou organizaci a také dimerizuje. LEDGF hraje roli i v HIV infekci nebo vzniku rakoviny, což zdůrazňuje důležitost studia těchto „naváděcích“ proteinů. Pro hlubší porozumění navedení k chromatinu je důležité znát strukturu JIL-1:JASPer komplexu. Dostupná je jen predikce struktury jednotlivých proteinů a komplexu v programu AlphaFold. Pro experimentální ověření byly vazebné domény obou proteinů rekombinantně produkovány a purifikovány pro NMR analýzu. Dynamická dimerizace JASPeru interferovala s měřením, proto byly připraveny zkrácené konstrukty JASPeru pro ovlivnění dimerizace. S vybraným konstruktem byly následně provedeny crosslink experimenty, jako vhodné doplnění strukturních metod. Prozatím byla potvrzena tvorba dimeru a komplexu. Tyto poznatky přispějí k objasnění regulace transkripce eukaryotních organismů.

Matrixový protein MA je N-koncová doména Gag polyproteinu Masonova-Pfizerova opičího viru M-PMV, jenž je zodpovědná za jeho interakci s cytoplasmatickou membránou hostitelské buňky během pozdní fáze virové infekce. N-koncový glycin matrixového proteinu je myristoylován a tato posttranslační modifikace je esenciální pro vazbu Gag k membráně. Tato vazba je reversibilní, a proto musí matrixový protein existovat ve dvou stavech – ve stavu, kdy je myristát exponovaný a může zprotředkovat vazbu na membránu a ve stavu, kdy je zanořen do hydrofóbní kapsy matrixu, když se nachází volně v cytoplasmě. Přechod mezi těmito stavy se nazývá myristoylový přepínač. V rámci této práce se zabýváme identifikací spouštěčů myristoylového přepínače. Bylo zjištěno, že myristoylový přepínač řídí odštěpování MA od Gag virovou proteasou, čehož jsme využili pro jeho studium. Dále byl zkoumán vliv interakce matrixového proteinu s kalmodulinem. Kalmodulin je všudypřítomný a vysoce konzervovaný protein a je známo, že HIV-1 i další viry jej využívají při infekci buňky. Naše výsledky ukazují, že interakce s kalmodulinem podporuje vazbu matrixového proteinu M-PMV na cytoplasmatickou membránu a spouští myristoylový přepínač.

Účinná izolace genetického materiálu a bílkovin má zásadní význam pro dosažení relevantních výsledků celé analýzy. Prvním krokem efektivní izolace DNA s vidinou velkého výtěžku je zvolení vhodné homogenizace. Cílem této práce je určení vhodného způsobu homogenizace rybí svaloviny před genetickou a následně i proteomickou analýzou. Byly porovnány tři způsoby homogenizace vzorku (analytický mlýnek, vysokotlaká homogenizace, FastPrep) se vzorkem nehomogenizovaným. Jako vzorek byly zvoleny filety z lososa obecného (Salmo salar), pstruha duhového (Oncorhynchus mykiss) a pstruha „lososovitého“ (Oncorhynchus mykiss). Izolace DNA byla provedena metodou využívající cetyltrimethylamonium bromid (CTAB) a její koncentrace byla následně měřena spektrofotometricky i fluorimetricky. Kvalita izolované DNA byla ověřena pomocí horizontální agarosové elektroforézy. Poté následovala qPCR, ve které byly použity primery amplifikující mitochondriální gen cytochrom c oxidázy podjednoty I (COI). V následujícím kroku analýzy byla provedena Sangerova sekvenace a DNA barcoding pro druhové ověření vzorků ryb. Další práce bude věnována vlivu homogenizace na proteomickou analýzu.